Факультет

Студентам

Посетителям

Способы обнаружения мицелия в растении

Методы осветления растительного материала

При микроскопировании препаратов листовой ткани содержащийся в клетках хлорофилл сильно ухудшает их прозрачность.

Удалить хлорофилл можно различными способами, хотя при осветлении клетки растительных тканей в большей или меньшей степени деформируются.

Осветление в спирте. Материал кипятят в абсолютном спирте до полного обесцвечивания. Для этого кусочки листьев помещают в пробирку, до половины наполненную спиртом, и с помощью деревянного зажима косо держат ее над пламенем бунзеновской горелки горлышком от себя. Время от времени пробирку отводят от пламени и слегка встряхивают, проводя эту операцию до обесцвечивания ткани. Затем кусочки листьев промывают в воде и обрабатывают красителем.

Осветление калийной щелочью. В литературе описаны многие методы осветления растительных препаратов с помощью калийной щелочи. В качестве примеров ниже приведены две методики.

1. Кусочки листьев в течение 20—30 мин (в зависимости от толщины) кипятят в 10—50%-ном растворе щелочи, промывают, 2—3 мин нагревают в спирте и еще раз промывают водой.

2. Кусочки листьев выдерживают 2 ч в 20%-ном растворе едкого кали, затем 2 ч в ледяной уксусной кислоте, промывают водой, 1—2 мин нагревают в спирте и еще раз промывают.

После осветления препараты окрашивают.

Осветление в растворе Аманна. По Кираи с соавт., для приготовления простых препаратов вместо воды можно использовать раствор Аманна, который улучшает прозрачность. Состав раствора: 20 г молочной кислоты, 40 г глицерола, 20 г фенола, 20 мл дистиллированной воды. Существенную роль в осветлении играет молочная кислота, поэтому препараты можно осветлить также простым кипячением в ней.

Методы обнаружения мицелия

Быстрый и дешевый метод — окрашивание измельченного или осветленного материала. Поместив кусочек ткани на предметное стекло, наносят каплю 1%-ного раствора хлопковой сини, кислого фуксина или смеси одного из красителей с ледяной уксусной кислотой (1 мл 1%-ного раствора хлопковой сини + 10 мл ледяной уксусной кислоты). Через 10—20 мин препарат промывают водой с помощью капельницы, накладывают покровное стекло и проводят микроскопирование. Для окрашивания можно также использовать смесь обоих красителей. По Андерсену и Роуэллу, смесь из 2 мг хлопковой сини, 5 мг кислого фуксина, 0,2 мл ледяной уксусной кислоты, 35 мл 95%-ного спирта и 23 мл воды дает хорошие результаты при окрашивании ржавчинных грибов. Ее наносят на препарат пульверизатором и после достаточного окрашивания смывают водой. Ростковые трубки мицелия, находящиеся на поверхности листа, окрашиваются в красный цвет, а проникшие внутрь гифы приобретают голубую окраску.

Кроме фуксина и хлопковой сини можно использовать генциан-виолет, кристалл-виолет, метиленовую синь и другие красители. Красящий эффект усиливается при добавлении фенола, хотя фенол окрашивает также разрушенные клетки и различные примеси в препарате, что несколько осложняет работу малоопытного лаборанта.

Очень активна смесь лактофенола с хлопковой синью, широко применяемая в лабораторной практике для окрашивания фитопатогенных грибов.

Состав лактофенол-хлопковой сини по Гаге: из 1 г хлопковой сипи, 50 г фенола, 50 г молочной кислоты, 50 г глицерина, 100 мл дистиллированной воды готовят маточный раствор, применяя его в чистом виде или разбавленным дистиллированой водой (1:9). Пораженные части растения выдерживают в растворе 5—10 мин, промывают и используют для приготовления водного препарата. Этим составом окрашиваются органы грибов в очень тонких листьях, срезах листьев или на поверхности тканей.

Обнаружение мицелия ржавчинных грибов в листьях пшеницы по Шиптону и Брауну. Пораженные листья разрезают на кусочки и сразу помещают в пробирку или колбу с спиртовым раствором лактофенол-хлопковой сини.

Красящий раствор состоит из двух частей 95%-ного спирта и одной части лактофенол-хлопковой сини (10 г фенола, 10 г молочной кислоты, 10 г глицерина, 0,02 г хлопковой сини, 10 мл дистиллированной воды). Смесь доводят до кипения, 1 мин слабо кипятят, затем дают кусочкам листьев осесть и еще раз доводят до кипения на 30 сек. После этого материал оставляют в красящем растворе на 48 ч при комнатной температуре, промывают водой и кладут на 30—50 мин в хлоралгидрат (5 г хлоралгидрата в 2 мл воды). Если клетки стали прозрачными, а мицелий хорошо окрасился, кусочки листа переносят в 50%-ный глицерин на предметном стекле.

В таком виде препараты можно длительно хранить. При неудовлетворительном окрашивании и осветлении материал повторно кипятят в красителе и выдерживают в хлоралгидрате.

Примечание. Кусочки листьев можно оставлять в красящем растворе в течение недели, не опасаясь избыточного окрашивания. Составляя раствор, нужно точно соблюдать дозы красящих компонентов. При избытке красителя в растворе ухудшается осветление, при недостатке удлиняется окрашивание. Препараты пригодны для просматривания в проходящем свете и фазово-контрастном микроскопе. Особенно хорошо окрашиваются листья, пораженные мучнисторосяными и ржавчинными грибами, а также возбудителями листовых пятнистостей.

Обнаружение мицелия пыльной головни (Ustilago nuda) в семенах ячменя. Семена ячменя кипятят 1 ч в одномолярном растворе едкого натра и силиката натрия. Зерновки превращаются при этом в желеобразную массу, и зародыши легко отделяются от эндосперма. Зародыши отмывают на сите, кипятят в лактофеноле и затем окрашивают в 0,05—0,08%-ном растворе трипанблау в лактофеноле. Мицелий в зародышах становится темно-синим.

Обнаружение мицелия пыльной головни в семенах пшеницы (шотландский метод). Около 120 г семян выдерживают 22 ч при 22—24°С в 1 л 5%-ного раствора едкого натра с 0,15 г трипанблау, затем переносят в аппарат Фенвика и промывают водой при 60—65 °С. Зародыши отделяются от зерновок, всплывают и проходят через сито. После двухминутного промывания 95%-ным спиртом их переносят на фильтровальную воронку с краном, которую заполняют смесью из трех частей лактофенола и одной части воды. Зародыши всплывают, остальные части оседают на дно, и их выпускают из воронки. Эту операцию повторяют до тех пор, пока в воронке не останутся одни зародыши, их еще раз кипятят 2 мин в лактофеноле и исследуют под микроскопом. В пораженных зародышах виден мицелий, окрашенный в синий цвет.

Обнаружение возбудителя желтой ржавчины (Puccinia striiformis) в листьях ячменя флуоресцентно-микроскопическим методом по Опелю и Шлетелю. Зараженные листья кипятят 90 сек в смеси лактофенола и этанола (1:2) и оставляют на 48 ч при комнатной температуре, заменяя раствор через 24 ч. Затем листья нагревают 10 мин в этой смеси, переносят на 10 мин в чистый лактофенол в кипящей водяной бане, повторно выдерживают 15 мин при комнатной температуре в смеси лактофенола с этанолом, затем два раза по 15 мин в двух сменах 0,05 М раствора NaOH и трижды — в дистиллированной воде. Промытые листья обрабатывают 30 мин 0,1 М трис-HCl буфером (pH 8,5) и окрашивают 5 мин свежеприготовленным раствором вобитала 3 BTZ в том же буфере концентрацией от 0,1% до насыщения. Окрашенный материал промывают четыре раза по 10 мин в дистиллированной воде и помещают в глицерин на предметное стекло. Споры и ростковые трубки мицелия флуоресцируют синевато-белым цветом, базальные клетки гаусторий — слегка зеленоватым, сами гаустории не видны.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: