Факультет

Студентам

Посетителям

Сбор, культивирование и исследование хищных грибов

Хищные грибы можно легко получить почти из всех типов гниющего растительного материала, например листового перегноя, садового компоста, гниющей древесины и т. д. Они обычно находятся также в навозе, а многие из них можно обнаружить в зарослях мха, особенно у основания стеблей, где растения соприкасаются с почвой.

Материал, собранный в поле, следует принести в лабораторию в закрытых сосудах (в пробирках или жестянках из-под табака), чтобы сохранить его влажность. После сбора его возможно быстрее следует использовать для закладки первичных культур. Если образцы достаточно влажны, их можно без опасения хранить в течение одной или двух недель, а более крупные образцы — и дольше. Если в течение одного обхода взято несколько образцов, то нужно следить за тем, чтобы в процессе сбора не занести хищные грибы или их споры из одного образца в другой; лопатка или нож, используемые при сборе, должны быть после каждого сбора тщательно очищены и, если возможно, протерты денатурированным спиртом. Лучше всего пользоваться шпателями из деревянных щепок, которые можно выбрасывать после взятия каждого образца. Если пробирки или жестянки раньше не использовались для сбора хищных грибов, их стерилизовать не нужно, но если они используются вторично, то их необходимо вымыть и простерилизовать путем кипячения или в автоклаве. Не следует забывать о том, что и руки сборщика также могут случайно занести материал из одного образца в другой.

Образцы следует этикетировать в момент сбора и, помимо этикетки на пробирке или коробке, хорошо вложить дополнительную этикетку внутрь пробы; если она будет написана карандашом, то независимо от степени влажности образца останется разборчивой. В полевую записную книжку следует записать время сбора, тип материала, место — предпочтительно со ссылкой на карту — и все другие детали, которые позднее смогут иметь какое-либо значение, например характер окружающей растительности, погодные условия и т. п. Просто поразительно, какое значение могут приобрести мелкие детали такого рода спустя годы после того, как образец был собран, исследован и забыт. Поэтому сведения об образце следует как можно скорее переписать из полевой книжки в более надежное место, потому что страницы полевой книжки почти неизбежно разрываются на этикетки для образцов, используются для разжигания трубки или иным путем оказываются потерянными для науки.

Для приготовления первичных культур хищных грибов из исходных образцов следует использовать бедную питательную среду для подавления роста более крупных видов плесневых грибов. Особенно низким должно быть содержание сахара. Хорошую среду можно приготовить на кукурузном агаре. Для этой цели берется: измельченных зерен кукурузы 20 г, агара 20 2 и водопроводной воды 1000 мл.

Измельченные зерна кукурузы заливают 1200 мл водопроводной воды и нагревают в течение часа при температуре 70—80°. После охлаждения и оседания осадка 1000 мл жидкости, находящейся на поверхности, фильтруют, если нужно, через стеклянную вату, добавляют агар и расплавляют его в автоклаве. Литр среды удобнее всего разлить в 3 конические колбы емкостью 500 мл, которые затем закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин. под давлением 1 ат.

Слой агара в чашках для первичных культур хищных грибов не должен быть очень толстым (глубоким), так как это может затруднить последующие наблюдения; вопреки обычным правилам агар нужно заливать в колбы горячим, чтобы образующаяся при этом конденсационная влага предохранила его от слишком быстрого высыхания. Так как первичные культуры приходится выдерживать по крайней мере 3 месяца, то предохранение их от высыхания всегда является проблемой. Для сохранения влажности культуры полезно держать под колпаком или в закрытой жестяной коробке.

При закладке культур небольшое количество собранного материала помещают в середину слоя агара при помощи стерильного скальпеля или пинцета. В тех случаях, когда одновременно закладывают культуры из нескольких образцов, удобно иметь под рукой широкогорлый сосуд с денатурированным спиртом; между взятием материала из различных образцов пинцет стерилизуют, для чего его обжигают, а потом охлаждают, погружая в спирт, который быстро выгорает при последующем использовании пинцета.

Число чашек Петри, инокулируемых из каждого образца, зависит от того, сколько времени будут вестись последующие наблюдения. Полагается ставить не меньше 3 чашек; использование больше 12 штук не дает никаких преимуществ, за исключением случаев особенно исчерпывающего изучения какого-либо образца; в таких случаях количество чашек может исчисляться сотнями. Однако интенсивные исследования подобного рода лучше предоставить специалистам.

При исследовании почвы на содержание хищных грибов культуры закладывают иным способом. Небольшое количество почвы, подлежащей исследованию, рассыпают по дну пустой стерильной чашки Петри; агар, предварительно охлажденный примерно до температуры его затвердевания, наливают сверху почвы, после чего агар и почву осторожно перемешивают. Агар, применяемый в этих случаях, должен содержать очень мало питательных веществ. При использовании агара, приготовленного по вышеприведенному рецепту на кукурузной муке, кукурузный отвар следует до добавления агара разбавить по крайней мере 3 частями воды. Вместо кукурузного отвара лучше даже использовать слабый настой экскрементов кролика.

При выделении хищных грибов из почвы часто оказывается, что в культурах или мало нематод или совсем их нет. Так как способность хищных грибов конкурировать с плесенями обусловливается их плотоядным образом жизни, то отсутствие добычи может помешать их появлению в культуре. Поэтому почвенные культуры следует обеспечить нематодами. Нематоду Ditylenchus dipsaci можно легко получить, намочив в воде немного сухого растительного материала, содержащего этих нематод; вылупляющихся личинок можно выделить из частиц материала при помощи сепаратора Бэрмана. Этот прибор представляет собой обычную воронку для фильтрования с куском резиновой трубки и зажимом. Материал, содержащий нематод, завертывают в кисею и помещают в воронку, которую заполняют водой. Прибор оставляют в таком положении на 24 часа; за это время нематоды проходят через материю и спускаются в нижний конец резиновой трубки, откуда их можно извлечь, ослабив зажим. Другой способ получения нематод для стимулирования активности грибов состоит в содержании культур нематод на агаре, приготовленном на экскрементах кролика; в основном этот способ хорош, но иногда может подвести исследователя в самый ответственный момент.

Первичные культуры, полученные вышеописанными методами, содержат при комнатной температуре и периодически исследуют на содержание хищных грибов. В термостат их ставить не следует, так как относительно низкая температура более благоприятна для грибов. Свободноживущие хищные грибы обычно появляются довольно быстро, но иногда, особенно при недостатке нематод, они могут встречаться только небольшими группами. Иногда их можно распознать по спорам, которые часто бывают видны на концах воздушных конидиеносцев, вырастающих из материала, использованного в качестве инокулума; поэтому каждый раз, как производится осмотр культуры, следует тщательно осмотреть при слабом увеличении микроскопа и инокулум.

Свободноживущие хищные грибы могут появиться через несколько дней после постановки культуры, но нередко появление их задерживается; поэтому выбрасывать культуры можно не раньше, чем после трехмесячного периода наблюдений.

Гораздо труднее обнаружить внутренних паразитов нематод, например Harposporium. Для этого нужно отыскивать мертвых нематод с выходящими из них гифами; при этом часто полезно бывает перевернуть чашку Петри и исследовать культуру через ее стеклянное дно, так как нематоды, пораженные Harposporium и подобными ему грибами, часто, погибая, опускаются на дно агара и поэтому остаются незамеченными при наблюдении сверху. Для отметки местоположения обнаруженного экземпляра, который может понадобиться позднее для более детального исследования, рекомендуется при слабом увеличении микроскопа навести кончик пера автоматической ручки на то место стеклянного дна чашки Петри, под которым непосредственно лежит зараженная нематода; при слабом нажатии на кончик пера на стекле остается небольшое чернильное пятнышко, которое быстро высыхает и, подобно бую на воде, отмечает местонахождение нематоды.

Если хищные грибы, улавливающие нематод, обнаружены, то их следует по возможности выделить в чистую культуру. При наличии спор этих грибов выделение произвести легко, сняв споры с вершины воздушного конидиеносца при помощи стерильной иглы с очень небольшой частицей стерильного агара на конце и перенеся их в чашку с кукурузным агаром. Лучше всего эту операцию производить под бинокулярным микроскопом. Выбрав конидиеносец с удобным расположением спор, нужно поднять объектив микроскопа примерно на 1 см, навести фокус на конец иглы и, сохраняя ее в поле зрения, опускать объектив до тех пор, пока цель не появится в поле зрения. Подобный способ дает возможность осторожно подвести иглу к споре и избежать опасности случайного прикосновения к поверхности агара. Любая попытка подвести иглу к спорам, сохраняя последние в фокусе, неизбежно оканчивается неудачей.

Грибы, улавливающие нематод, обычно хорошо растут в чистой культуре на агаре, сваренном на кукурузном отваре, но они, как правило, не образуют ловушек до тех пор, пока не появятся нематоды. Чтобы вызвать образование ловушек, лучше внести небольшое количество гриба в культуру нематод, чем добавлять нематод в чистую культуру гриба.

Может случиться, что культура начнет катастрофически высыхать прежде, чем полностью закончится исследование найденных в ней интересных грибов. В таких случаях ее можно омолодить, налив слой свежего агара сверху старого; агар предварительно следует охладить примерно до температуры его затвердевания, как это делается при постановке почвенных культур. Агар для этой цели следует применять или чистый, или приготовленный на слабом настое кроличьих экскрементов, так как если вновь добавляемая среда будет богата питательными веществами, то начнется чрезмерно сильное развитие плесневых грибов.

При предварительном исследовании культур с чашки Петри снимают крышку и внимательно осматривают поверхность агара при помощи 16-миллиметрового объектива. Бинокулярная лупа не пригодна для этой цели, так как при обнаружении интересного экземпляра последний нужно сейчас же исследовать при похмощи более сильного объектива. Я установил, что для предварительного просмотра наиболее удобен 9-миллиметровый объектив; поле зрения его достаточно велико и позволяет быстро просмотреть всю поверхность культуры, а в случае необходимости более подробного исследования можно путем замены окуляра, дающего шестикратное увеличение (Х6), окуляром X 15 обеспечить требуемое увеличение изображения. На этой стадии исследования следует искать мертвых нематод, особенно если они встречаются группами, гифы, несущие ясно заметные ловушки, и споры хищных грибов.

Более детальное исследование интересующего нас материала можно производить in situ (на месте), поместив каплю воды на поверхность агара и закрыв ее покровным стеклом или, что еще лучше, используя сильный объектив с водной иммерсией. Однако при этом способе трудно обеспечить правильное освещение исследуемого объекта, так что для детальных наблюдений следует приготовить специальный препарат. Проверочные исследования хищных грибов следует всегда производить на живом неокрашенном материале, если только не требуется изучить различные явления в клеточных ядрах, так как ввиду нежного строения грибов они мало пригодны для изготовления постоянных препаратов.

Для подготовки свежего материала к исследованию нужно вырезать участок агара из культуры и лезвием бритвы срезать с него поверхность, несущую интересующий нас гриб. Полученный тонкий срез агара можно затем поместить в воду, используя для этого предметное стекло с углублением (для висячей капли). Этот способ дает возможность вести дальнейшие исследования в наилучших условиях. Неудобство этого метода заключается в толщине предметного стекла, которая обычно не допускает использования апланатического конденсора с большой апертурой для получения наибольшей резкости изображения: избежать этого неудобства сможет тот, кому удастся достать очень тонкое предметное стекло, какие иногда появлялись в продаже еще до войны. У меня имеется одно такое стекло, общая толщина которого меньше 1 мм; оно вполне пригодно для работы с апланатическим масляно-иммерсионным конденсором с численной апертурой 1, 4, и я храню его еще тщательнее, чем самый микроскоп!

Иногда толщина нематод может вызвать затруднения, так как 2-миллиметровый иммерсионный объектив может коснуться покровного стекла при фокусировании стороны животного, удаленной от наблюдателя. Трехмиллиметровый иммерсионный апохромат разрешает эту проблему, так как численная апертура этого объектива такая же, как у 2-миллиметрового, но сочетается со значительно более длинным фокусным расстоянием.

Чтобы собрать требуемые сведения о хищных грибах, необходимо изготовлять постоянные микроскопические препараты, хотя при этом надо еще раз со всей строгостью подчеркнуть, что всюду и везде, где это возможно, исследования нужно проводить на живом материале. Вполне удовлетворительные препараты можно приготовлять, пользуясь классическим лактофенольным методом. Объект помещают на предметное стекло в каплю Лактофенола с анилиновой синей (cotton blue) и подогревают до тех пор, пока от жидкости не пойдет пар, после чего закрывают его покровным стеклом. Если обмазать края покровного стекла красным лаком для ногтей, то такой препарат можно с полным основанием считать постоянным. Описанный метод вполне пригоден для окраски и монтажа спор хищных грибов, равно как и для внутренних паразитов нематод, но для хищников типа Arthrobotrys и близких к нему форм он мало пригоден.

Для более нежных хищных грибов рекомендуется эритрозино-глицериновый способ. Кусочек агара с находящимся на нем экземпляром гриба вырезают из культуры и фиксируют в растворе формалина с уксусной кислотой.

Фиксация должна продолжаться по крайней мере 24 часа, но материал можно без всякого вреда для него оставлять в этом фиксаторе на целые годы. В течение следующих 24 час. материал промывают несколько раз в воде. Поверхность куска агара с находящимся на ней грибом срезают бритвой и помещают в насыщенный водный раствор эритрозина не меньше чем на 30 мин.; перекрасить препарат невозможно, поэтому лучше оставлять его в краске на всю ночь. После краски материал 2—3 раза промывают в воде и переносят в каплю 10%-ного глицерина на часовое стекло, которое оставляют незакрытым, чтобы концентрация жидкости достигла уровня вязкости чистого глицерина. Процесс достижения первоначального объема длится около двух дней. Остатки воды извлекаются из препарата уже в эксикаторе, после чего экземпляр при возможно более низкой температуре монтируют в капле расплавленного глицеринового желе.

При помощи описанного метода можно получать прекрасные препараты эндозойных хищных грибов; он вполне пригоден и для большинства свободноживущих хищных грибов.

Постоянные препараты хищных грибов в канадском бальзаме приготовить нелегко, потому что и споры и приспособления для ловли нематод имеют тенденцию сильно сжиматься в процессе обезвоживания. При условии очень медленного обезвоживания можно получить вполне удачные препараты в «Евпарале» (Euparal). Кусочки агара фиксируют в формалине с уксусной кислотой, отмывают и, как и в предыдущем случае, срезают бритвой тонкий слой агара с грибом. Затем срезы агара слегка окрашивают гематоксилином Делафилда; допускать чрезмерно сильного окрашивания не стоит, так как дифференциация подкисленным спиртом редко бывает успешной. После окраски материал «подсинивают» парами аммиака и очень медленно обезвоживают, применяя постепенно повышающиеся концентрации спирта; когда обезвоживание заканчивается перенесением в абсолютный спирт, материал можно промыть в «экстракте Евпарала» и монтировать в «Евпарал» на предметных стеклах, лучше с углублениями, ввиду толщины срезов агара.

Если срезы агара хотят монтировать в канадском бальзаме, то их предварительно следует просветлить в терпинеоле, но этот метод не рекомендуется. Просветлять препараты в ксилоле можно только в том случае, если исследователь не боится длительного процесса обезвоживания, в течение которого препарат проводят через постепенно повышающиеся концентрации ксилола в абсолютном спирте.

В литературе описываются и другие, более сложные, методы получения хороших препаратов хищных грибов в канадском бальзаме или в венецианском терпентине; ссылки на эти работы имеются в нашем списке литературы.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: