Факультет

Студентам

Посетителям

Рибонуклеаза и метод «дактилографии»

Обнаружение и исследование химических различий между гомологичными белками обычно осуществляют при помощи так называемой «дактилографии».

Этот метод основан на разделении пептидов, возникающих при расщеплении белков протеолитическими ферментами, при помощи физических методов, дающих воспроизводимые результаты. Определив расположение этих пептидов для исходного «стандартного» белка, легко обнаружить различия в продуктах расщепления того же белка, полученного из других биологических источников, и выяснить природу химических изменений этих пептидов с использованием классических методов исследования аминокислотного состава и последовательности расположения аминокислотных остатков.

Пример сравнения «дактилограмм», где изображены «дактилограммы» пептидов рибонуклеазы быка и барана. Различия в расположении пептидов выражены весьма четко и повторяются от опыта к опыту. В данном случае рибонуклеазу расщепляли сначала трипсином, а затем химотрипсином. Перед расщеплением белок окисляли надмуравьиной кислотой, чтобы избежать стерических препятствий, связанных с наличием дисульфидных связей.

Этот метод очень прост, не требует много времени и поэтому весьма удобен для предварительного обнаружения различий в белках. Умело, используя микрометод, который так успешно применили Сэнджер и его сотрудники для выяснения структуры инсулина, можно с довольно большой точностью провести полное сравнение состава пептидов, изображенных на этих «дактилограммах». Следует, однако, указать, что при использовании таких методов всегда возможны некоторые неточности за счет компонентов, слабо реагирующих с нингидрином; это обычно осложняет работу, так как часто бывает трудно решить, вызвано ли какое-либо слабо заметное пятно присутствием следовых количеств какого-то пептида, действительно входящего в состав исследуемого белка, или же это просто результат загрязнения бумаги. В связи с этим часто предпочитают использовать хроматографию на ионообменных смолах, а не хроматографию и электрофорез на бумаге, так как первая дает возможность более точного количественного определения выхода фрагментов белка и сравнения его с теоретически ожидаемым. Однако если нужно сравнить строение большого количества белков и если опытным путем установлены пределы возможных ошибок, то можно использовать более быстрый и более удобный метод хроматографии на бумаге, позволяющий установить основные признаки сходства в структуре исследуемых белков.

Исследование видовых различий в структуре ферментов представляет особый интерес, так как во многих случаях мы можем судить об этих различиях по способности фермента катализировать ту или иную специфическую химическую реакцию. Так, например, в результате благоприятной мутации, вызвавшей замену одного несущего заряд аминокислотного остатка, важного для деятельности фермента, другим незаряженным остатком, мы можем сделать важные выводы о природе и локализации участка, на котором происходит присоединение фермента к молекуле субстрата.

Аминокислотный состав рибонуклеазы из поджелудочной железы быка и барана. Рибонуклеаза барана содержит меньше лизина, треонина и, возможно, аспарагиновой кислоты и больше серина и глутаминовой кислоты, чем рибонуклеаза быка. Методом анализа концевых групп установлено, что у обоих белков N-концевой аминокислотой служит лизин. Кроме того, оказалось, что константы седиментации этих белков, определенные методом ультрацентрифугирования, по существу, идентичны. Результаты количественного определения аминокислотного состава пептидов рибонуклеазы, разделенных по методу.

При гидролизе окисленной рибонуклеазы трипсином и химотрипсином образуются пептиды такого состава, какого можно было ожидать на основании частично установленной структуры этого фермента. Соответствующие пептиды, полученные из рибонуклеазы барана, также можно отнести к определенным участкам этой формулы. Те фрагменты полипептидной цепи рибонуклеазы барана, которые отличаются от соответствующих фрагментов рибонуклеазы быка, можно было локализовать в определенных участках цепи на основании их состава. Отсутствие в одном участке цепи рибонуклеазы барана пептида, содержащего лизин и чувствительного к действию трипсина, предотвращает расщепление цепи в этом месте, тогда как рибонуклеаза быка в данном участке расщепляется. В результате образуется один длинный пептид (пептид 10) вместо двух пептидов, полученных из рибонуклеазы быка.

Исследования по изучению различных аспектов зависимости между структурой и функцией, позволяют предположить, что дисульфидный мостик, связывающий полуцистиновые остатки 1 и 6, можно разрушить, не вызывая полной потери рибонуклеазой каталитической активности. Видовые различия, наблюдающиеся в области 37-го остатка, где несущая положительный заряд аминокислота — лизин — заменена несущей отрицательный заряд глутаминовой кислотой, также наводят на мысль о том, что эта часть полипептидной цепи не является необходимой для присоединения субстрата и гидролиза.