Важный фактор эффективности искусственного осеменения — максимальное использование выдающихся высокоценных производителей путем осеменения многих самок спермой одного эякулята.
Для этого необходимо разбавить сперму, чтобы увеличить ее объем и обеспечить сохранность оплодотворяющей способности на продолжительный срок.
Разбавляют сперму специальными средами — биологическими и синтетическими. Главные требовании к среде — это создание условии, которые предупреждали бы расходование внутренних энергетических запасов в спермиях, обеспечили способность длительной выживаемости вне организма и сохранности их оплодотворяющей способности.
Разбавитель, как правило, состоит из нескольких компонентов, каждый из которых выполняет определенную биологическую роль.
В качестве основы синтетической среды используют раствор неэлектролита (глюкоза, лактоза, сахароза, раффиноза). Сахара нейтрализуют вредное действие электролитов, то есть защищают спермии от снятия электрического заряда (не допускают агглютинации), вместе с тем они являются материалом для гликолиза и дыхания.
Для устранения или ослабления температурного шока спермиев в разбавитель вводят желток куриного яйца, который повышает их устойчивость к охлаждению.
Важный компонент среды, предохраняющий спермии от самоотравления кислыми продуктами распада и создающий буферность среды, — соль лимонной кислоты — натрий лимоннокислый, трехзамещенный, пятиводный (цитрат натрия). Дополнительными компонентами для синтетических сред могут быть сульфаниламид (белый стрептоцид) и антибиотики (пенициллин, стрептомицин и т. д.), которые вводят в разбавитель для предупреждения развития микроорганизмов, и глицерин, применяемый при замораживании спермы во избежание стадии кристаллизации жидкости, повреждающей спермии.
Кроме того, для приготовления сред также можно использовать следующие вещества: калий фосфорнокислый, натрий двууглекислый, магний сернокислый, калий хлористый, аммоний сернокислый очищенный.
Среды для разбавления спермы могут быть приготовлены непосредственно на станции или из сухих заготовок, выпускаемых промышленностью. При этом они должны иметь физико-химические свойства, при которых осмотическое давление было бы наиболее благоприятно для спермиев. Достигается это точным взвешиванием на аналитических весах необходимых компонентов в соответствии с рецептом разбавителя. Среда не должна содержать пахнущих и ядовитых веществ, солей металлов (свинец, олово и т. д.).
Качество компонентов весьма важно и к применению допускают только те на них, которые имеют этикетки с установленными обозначениями — наименование предприятия, выпустившего реактив, название и степень чистоты, помер контрольного анализа. Хранят реактивы в сухом темном месте, в стеклянных банках, плотно закрытых притертыми стеклянными или корковыми пробками. Готовят разбавитель непосредственно перед его применением с тем, чтобы от времени приготовления до использования проходило не более 3 ч. Для приготовления среды в стеклянный сосуд отвешенные по рецепту компоненты высыпают и добавляют необходимое количество прокипяченной дистиллированной воды и легким покачиванием размешивают до полного растворения. Приготовленную таким образом среду стерилизуют в водяной бане путем кипячения в течение 5—10 мин и после охлаждения до 35—40° в нее добавляют антибиотики, желток и глицерин.
Для получения желтка используют свежие куриные яйца, которые моют, насухо вытирают, протирают спиртовым (70°) тампоном и скорлупу раскалывают пополам. Белок отделяют в чашку, а желток, предварительно сняв с него остатки белка фильтровальной бумагой, прокалывают скальпелем и сливают в стеклянную мензурку. Необходимое количество желтка вносят в сосуд с разбавленными компонентами и тщательно размешивают. Яйца должны быть от здоровых кур, из хозяйств, благополучных по инфекционным заболеваниям птицы.
Сперма должна быть разбавлена не позже чем через 10 мин после получения на вагину. Перед разбавлением сперму оценивают и определяют ее объем. При этом следует строго соблюдать предосторожность, учитывая, что спермии очень чувствительны к условиям среды. Во избежание такого влияния разбавитель и вся посуда, используемые при разбавлении, должны быть близки к температуре спермы. Среду небольшими порциями добавляют к сперме и осторожно смешивают. После разбавления сперму обязательно проверяют по активности под микроскопом.
Биологический контроль среды определяют по выживаемости спермиев при температуре 2—4° при различных степенях разбавления спермы. Каждая поступившая серия компонентов, а также антибиотиков, сульфаниламидов, входивших в состав среды, должна быть проверена на безвредность.
Биоконтроль позволяет установить оптимальные степени разбавления спермы. В зависимости от концентрации и активности спермиев сперму производителей сельскохозяйственных животных разбавляют:
- быка в 20—50 раз с таким расчетом, чтобы о одной дозе разбавленной спермы при всех способах хранении перед осеменением животных было не менее 10 млн спермиев с прямолинейно-поступательным движением;
- барана в 2 (1:1)—4 (1:3) раза с концентрацией в дозе не менее 80 млн спермиев;
- хряка в 2 (1:1) —10 (1:9) раз, с концентрацией в дозе не менее 3 млрд спермиев;
- жеребца в 4 (1:3) раза с концентрацией в дозе не менее 3 млрд спермиев.
Разбавленную сперму для постепенного охлаждения помещают в водяную ванну температурой 35 ° и оставляют при комнатной температуре.
Спермии при прохождении по каналу придатка, обволакиваясь белковыми и жировыми веществами, приобретают коллоидный покров, который предохраняет спермии от разрушающего влияния солей, кислой реакции, токсинов, лизинов и агглютининов, при его передвижении в половых путях самца и самки. Там же они приобретают отрицательный электрический заряд, что позволяет им избежать склеивания (агглютинации). Пребывание в придатке семенника способствует более активному усваиванию сахаров, повышающих жизнеспособность спермиев при храпении спермы.
Канал придатка семенника имеет кислую реакцию, вследствие чего спермии, проходя через него, становятся малоподвижными. Это обстоятельство наряду с понижением температуры в мошонке способствует их лучшему сохранению (2—3 мес).
Чрезвычайно важное значение для жизнедеятельности спермиев имеет окружающая среда. Прежде всего любые изменения в плазме спермы отражаются на спермиях с особой силой. Большое влияние оказывает осмотическое давление. Для нормальной жизнедеятельности спермиев необходима изотоническая среда. В растворах с повышенной концентрацией веществ (гипертонических), а также с пониженной (гипотонических) спермии погибают, и чем больше отклонение от изотонии, тем скорее они гибнут. Вола действует на спермии губительно, у многих из них закручиваются хвосты, набухают головки. Поэтому соблюдение изотонического равновесия в сперме очень важно. Избыточная кислотность прекращает движение спермиев и убивает их. Чрезмерная щелочность сначала вызывает усиленные движения спермиев, но затем убивает их. Одно из важных условий внешней среды для жизнедеятельности спермий—это температура. Наиболее подвижны спермии при температуре, близкой к температуре тела (37—39°). Более высокая температура убивает их. При низкой температуре, близкой к 0°, переходят в состояние покоя. При резком охлаждении в спермиях может произойти температурный шок, особенно подвержены такому шоку спермии, только что полученные от производителя. Определенное влияние на них оказывает дневной свет. При кратковременном воздействии он не влияет, но хранить в течение нескольких часов спермии лучше в темноте. Прямые солнечные лучи и лучи бактерицидных ламп убивают спермии в течение 20—40 мин. Поэтому лаборатории лучше размещать на северной части помещения.
Все дезинфицирующие средства и большинство медикаментов весьма вредные для спермиев. Поэтому строго запрещено хранить в помещении, где находится сперма, медикаменты и дезинфицирующие вещества. Следует помнить, что даже следы мыла на посуде, полотенцах, предметных стеклах и т. д. могут убить.
На поддержание жизни и движение спермии расходуют энергию. Источником энергии для них является два биохимических процесса: это дыхание и фруктолиз.
Дыхание сопровождается окислением углеводов, липидов и белков. В первую очередь окисляются моносахариды и только при их отсутствии используются липиды и белки. С повышением температуры дыхание усиливается, при понижении замедляется. По уровню дыхания можно определить качество спермы.
Второстепенным источником энергии является фруктолиз, то есть расщепление сахаров без участия кислорода. 15 результате выделяется в 20 раз меньше энергии, чем при дыхании.
Образующаяся в процессе жизнедеятельности спермиев молочная кислота выделяется через оболочку в окружающую среду. При хранении вне организма молочная кислота накапливается в плазме спермы. Такое накопление идет быстрее при высокой температуре и в густой сперме. Молочная кислота способствует торможению биохимических процессов в спермиях, вследствие чего последние впадают в состояние анабиоза (теряют подвижность, оставаясь живыми). При малой концентрации кислоты (до pH 6) наблюдается первая фаза анабиоза, когда спермии при повышении температуры до 40° начинают двигаться. Если pH ниже 6, наступает вторая фаза анабиоза, для преодолении которой сперму кроме нагревания разбавляют изотоническими растворами (цитратом натрия). В спермиях и анабиотическом состоянии дыхание и фруктолиз заторможены, вследствие чего сроки хранения спермиев увеличиваются. Вместе с тем молочная кислота действует токсически на спермии, и они начинают гибнуть. Поэтому при подготовке спермы к хранению необходимо учитывать, какие способы можно применить для хранения.