Факультет

Студентам

Посетителям

Пути накопления вирусного инфекционного материала в защите леса

Практическое применение эцтомопатогенных вирусов в защите леса предполагает разработку путей накопления инфекционного начала, способов внесении патогена в популяцию вредителя, методов оценки эффективности вирусологической борьбы и др.

Долгое время основным препятствием для широкого применения вирусов являлось отсутствие доступных производству методов массового получения инфекционного материала. В настоящее время известны, по крайней мере, 3 принципиальные возможности культивирования энтомопатогенных вирусов: инфицирование нативными вирусами чувствительных насекомых, использование культур клеток, насекомых и заражение вирусными нуклеиновыми, кислотами, клеток, не родственных насекомым, но, получение которых в массовых количествах не представляет особых трудностей.

Исследования последних лет показывают реальную возможность использования субклеточных систем для размножения вирусов. Несмотря на широкие принципиальные возможности культивирования энтомопатогенных вирусов, единственное практическое применение на современном этапе развития микробиометода имеет лишь 1-й путь, что связано с разработкой множества приемов массового разведения насекомых на синтетических и полусинтетических питательных средах в условиях лабораторных и промышленных инсектариев. Все вирусные препараты против вредных насекомых в нашей стране и за рубежом созданы на основе массового культивирования насекомых. Иные возможности накопления энтомопатогенных вирусов находятся в стадии лабораторных опытов.

Наиболее пригодны для размножения вирусов насекомые в фазе личинки. Способы получения большого количества личинок и пути их заражения различны. Первые опыты по практическому применению возбудителей полиэдрозов всех типов и гранулезов проводились с использованием материала, собранного непосредственно в природе. Этот метод не получил широкого распространения из-за большой трудоемкости и полной зависимости от случайных факторов. Большое распространение получил метод искусственного заражения насекомых в изолированном пространстве. Личинок для заражения собирают в природе или выращивают в лаборатории.

В Канаде используют два метода содержания соснового пилильщика Neodiprion swainei Midd. на естественном корме. В одном случае личинок выращивают в ящиках с сетчатым дном, куда помещают срезанные ветви сосны и опрыскивают их суспензией вируса в концентрации 1 млн. полиэдров в 1 мл. На 75 тыс. личинок требуется 50 мл суспензии. Больных и мертвых личинок собирают через 1—12 суток и используют для приготовления препарата. Во втором случае монтируют вертикально в виде карусели проволочные рамы. Ветви сосны с колониями пилильщика прикрепляют по всей площади рамы. Опрыскивание хвои вирусной суспензией и сбор личинок осуществляют, как и в случае содержания в ящиках.

Накапливают инфекционный материал для борьбы с рыжим сосновым пилильщиком следующим образом. В местах с высокой заселенностью сосновых культур вредителем ложногусениц собирают отряхиванием на полиэтиленовую пленку. Насекомых концентрируют в марлевых пологах с открытым верхом, куда постоянно помещают свежий корм для предотвращения расползания личинок. Насекомых заражают непосредственно в пологах с нормой расхода вирусных включений 1 млрд. на 100 тыс. личинок IV возраста. При оптимальной температуре (25— 27° С) гибель насекомых начинается уже на 4—5 сутки после заражения. Через 8—10 суток материал сортируют. При этом 75—80% насекомых гибнет от типично протекающего ядерного полиэдроза кишечного типа, 20—25% завивает коконы. В фазе эонимфы смертность составляет обычно 20% и выше; остальная часть насекомых дает имаго.

Количество инфекционного материала, получаемого при заражении природных популяций насекомых, может существенно меняться. Сопутствующие патогены (бактерии, грибы, паразитические простейшие) обычно снижают выход вируса, так как личинки гибнут на ранних этапах инфекционного процесса. Факторы среды, оказывающие влияние на физиологическое состояние насекомых, прежде всего температура и качество корма, оказывают влияние и на продукцию вирусов. Оптимальные условия содержания личинок благоприятны и для развития возбудителей вирозов. Существенное значение имеет вирулентность вирусов.

Как известно, выкормка тутового шелкопряда для получения шелка в настоящее время рентабельна на естественном корме. Хвоя и листва лесных пород дешевле листьев шелковицы и, естественно, дешевле любой искусственной среды. Поэтому стремление использовать для массового разведения лесных насекомых естественный корм представляется оправданным. Однако стоимость корма составляет небольшую часть стоимости размножения вирусов, основные затраты приходятся на заработную плату. Положительные и отрицательные стороны метода можно рассмотреть на примере массового размножения вируса ядерного полиэдроза на личинках Neodiprion sertifer Geoffr.

Пилильщика выкармливали непосредственно в очаге массового размножения в контейнерах 25, 18 и 14 дюймов с 6-дюймовыми заслонками со всех сторон и 8-дюймовым вентиляционным отверстием в крышке инсектария, снабженного мощной вытяжной трубой для устранения группового эффекта. Использовали личинок, собранных в природе. Вирусную суспензию вводили с кормом (107 полиэдров на 1 мл) путем опрыскивания хвои из ручного опрыскивателя; расход 4 мл на контейнер. В контейнере содержалось 100 колоний или 2 тыс. личинок. Смертность достигала «пика» на 8 сутки после инокуляции. Контейнеры вручную очищали от остатков корма и экскрементов и выбирали погибших личинок. Эта операция была наиболее трудоемкой — за один рабочий день удавалось получить 8 унций пораженных полиэдрозом личинок. После очистки суспензию хранили при 4° С и pH=7.

Производительность инсектария, обслуживаемого шестью рабочими, составляла 1,39·1011 полиэдров в сезон, стоимость получения 1·108 полиэдров (одна личинка) — 1 цент. На 1 акр расходуется 3·109 полиэдров, т, е. себестоимость вирусного препарата 0,74 долл./га.

Методы сбора патологического материала в природе или заражение насекомых, собранных в естественных популяциях вредителей с целью получения инфекционного материала для практического применения, можно рассматривать как 1-й этап в развитии вирусологической защиты леса. Несмотря на доступность и высокую эффективность, эти методы, видимо, не получат широкого распространения, так как требуют больших затрат ручного труда и зависят от природных факторов.

В настоящее время проводят работы по созданию вирусных препаратов на промышленной основе. В этом случае насекомых разводят в инсектариях в течение всего года на искусственных питательных средах. Различают 3 группы питательных сред в зависимости от состава входящих ингридиентов: олигидические — вещества естественного происхождения; меридические — одно вещество с химически неопределенным составом, обычно растительного происхождения; холидические, или синтетические. Наиболее широкое применение находят меридические среды. Ниже приведена пропись одной из наиболее характерных по составу полусинтетической среды для разведения яблонной плодожорки, которая полностью удовлетворяет пищевые потребности гусениц. Агар и казеин придают среде необходимую консистенцию и служат источником азота. С зародышами пшеницы насекомые получают белок, виг тамины и минеральные соли. Синтетические среды содержат наборы аминокислот, жиры (обычно растительное масло и холестерин), углеводы, витамины, смесь минеральных солей и вещества, поддерживающие определенное время физические свойства среды. В настоящее время рецептура искусственных питательных смесей разработана для многих видов насекомых, которые приносят вред лесу.

Главным преимуществом массового разведения насекомых на искусственном корме является возможность круглогодичной стационарной работы. Однако при небольшом объеме производства оно не окупает резкого увеличения трудоемкости процесса. Увеличение стоимости субстрата практически с нуля при использовании естественного корма до нескольких рублей при использовании полусинтетических сред можно не принимать во внимание, так как оно составляет ничтожную часть затрат на размножение вируса.

И. Харпер размножил вирус ядерного полиэдроза Peridroma sacia, используя искусственные среды. Яйца тщательно очищали и стерилизовали с поверхности 0,8%-ным хлороксом в течение 30 мин, затем промывали и высушивали; выкармливали в чашках Петри по 20 гусениц до IV возраста при относительной влажности 90—100% и температуре 25° С. Затем осуществляли Инокуляцию, гусениц пересаживали в кубы — по 10 особей в каждый на свежую среду. После развития вироза трупы гусениц мацерировали в растворе Варинга с малым количеством буфера. Полученную суспензию фильтровали и отстаивали при 4° С. После многократного удаления верхних слоев с помощью сифона осуществляли центрифугирование на центрифуге с зональным ротором, затем равновесное центрифугирование и наконец, центрифугирование в градиенте плотности сахарозы на ультрацентрифуге.

При выращивании личинок до IV возраста трудовые затраты составили 1 чел.-день на 300 особей, т. е. трудоемкость выращивания на искусственной среде в несколько раз выше, чем с использованием; вышеописанной простой техники. Полный цикл получения вируса требует трудовых затрат в 1 чел.-месяц на 3 тыс. гусениц. Для поддержания маточной культуры 200 гусениц требуется около 10 ч рабочего времени. На полусинтетических питательных средах выращены многие виды насекомых — вредителей лесного хозяйства.

Размножение насекомых на искусственных питательных средах позволяет получать однородный биологический материал в течение всего года независимо от наличия личинок в природе и механизировать все трудоемкие процессы. Однако при этом необходимо учитывать некоторые стороны эволюционной экологии вирусов. В частности, многими экспериментами показано, что вирусы насекомых формируются в значительной Мере под влиянием семейной К-селекции, направленной на отбор средне — и низковирулентных штаммов. В качестве примера можно привести результаты изучения перестройки генофонда вируса миксаматоза. В течение короткого времени после контакта с новым видом хозяина — кроликами в 1950 г. генофонд популяции вирусов перестроился в направлении понижения вирулентности. Следует отметить, что хорошо известный факт повышения вирулентности вируса после нескольких пассажей на одном хозяине не противоречит отмеченной закономерности и не имеет отношения к рассматриваемой проблеме.

Вирозы, вызванные полиэдро — и гранулообразующими вирусами, в острой форме могут протекать за 5—20 суток. Срок развития хозяина обычно бывает большим. В этих условиях количество вирусов в одной личинке возрастает с ее возрастом экспоненциально, а поскольку наиболее восприимчивы личинки первых возрастов, то коэффициент размножения вируса пропорционально возрастает с уменьшением вирулентности.

Таким образом, с одной стороны, вирусы насекомых далеко не реализуют свою потенциальную вирулентность, а с другой, есть все основания предполагать, что в условиях массового разведения селекция на повышение вирулентности перспективна и даже может быть проведена очень легко при отборе вирусосодержащих частиц из первых погибших в культуре индивидуумов. В настоящее время стратегия массового разведения направлена на максимизацию выхода полиэдров без учета их вирулентности. Вирусы размножают на ослабленном искусственным кормом хозяине таким образом, чтобы добиться гибели личинок в последних возрастах. Это соответствует селекции на низкую вирулентность. Наиболее перспективным направлением в массовой культуре вирусов является размножение их на культурах клеток.

Серьезные успехи в этой области достигнуты Т. Грейсом, добившимся размножения вируса цитоплазматического полиэдроза в переживаемых клетках насекомого. А. Беллет получил семь пассажей радужного вируса на подобной культуре. Методом флуоресцирующих антител выявлены очаги инфекции. Из 80 вирионов, адсорбировавшихся на клетке, в среднем один образует очаг размножения. Из одной клетки получается 40 тыс. вирионов. В 1970 г. Р. Гудвин добился репликации ядерного полиэдроза в культуре гемоцитов насекомых.

Разработан метод размножения ядерного полиэдроза на тканях, культивируемых in vitro, перспективный для промышленного использования.

Методика размножения вирусов в культурах тканей разработана в Институте молекулярной биологии АН УССР. Последними работами В. Д. Милосердовой и Е. М. Сухорада показана возможность выращивания in vitro клеток насекомых и использования их для размножения вирусов, не только свойственных данному насекомому, но и чужеродных энтомопатогенных вирусов. Это открывает еще большие перспективу для получения вирусных препаратов. Среды и технология культивирования разработаны детально.

В качестве примера техники размножения вирусов лесных вредителей рассмотрим размножение ядерного полиэдрообразующего вируса пяденицы Lambdina fiscellaria somnaria на культуре клеток гемоцитов Malacosonia disstria. Использовали суспензионную культуру гемоцитов линии IPR166, в течение долгого времени поддерживаемую в культуре (25 пересевов) на модифицированной среде Грассе в полистироловых флаконах. Зараженную гемолимфу после извлечения охлаждали до нуля, разбавляли в 25 раз вазовой средой, центрифугировали и стерилизовали путем фильтрования —1—2 мл полученной очищенной суспензии добавляли в культуру клеток, поддерживаемую до инокуляции при 28° С. Вирус размножался при 25° С. Вирулентность полученного вируса проверяли на гусеницах Lambdina fiscellaria fiscellaria, воспитывавшихся на бальзамической пихте. В тестовых гусеницах обнаружен полиэдроз. Полученный вирус полностью сохранял свою вирулентность.

Размножение вируса в культурах клеток открывает широкие перспективы микробиологической борьбы. При этом легко автоматизировать процесс и свести к минимуму энергетические, потери; открываются, широкие возможности селекции. Таким образом, этот метод совмещает достоинства двух вышеописанных и не имеет их недостатков.

Предполагается, что в дальнейшем микробиологическая борьба будет развиваться по пути размножения в культурах клеток высоковирулентных штаммов вируса, способных вызывать в диких популяциях эксплозивные эпизоотии. Возможно, что окажутся рентабельными комбинированные методы, сочетающие поддержание высоковирулентных штаммов, вируса на клеточных культурах с размножением вируса перед его использованием в полевых условиях.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: