Полимеразная цепная реакция (ПЦР) (polymerase chain reaction, PCR) в настоящее время все шире применяется для диагностики инфекционных болезней благодаря своим преимуществам по сравнению с обычными методами: высокой специфичности, чувствительности и быстроте анализа.
Принцип ПЦР состоит в том, что при помощи фермента ДНК-полимеразы in vitro многократно синтезируются копии определенного участка ДНК микроорганизма. И когда количество молекул ДНК достигает значительной величины, ее определяют методом электрофореза.
ПЦР — циклический процесс, каждый цикл которого включает в себя три стадии:
тепловую денатурацию исследуемой ДНК. При этом разрушаются водородные связи, соединяющие парные основания, и цепи ДНК расходятся, т. е. образуются одноцепочечные ДНК, которые доступны для праймеров (затравок) и ДНК-полимеразы. Длительность процесса 1 мин;
посадку (отжиг) праймеров на комплементарные участки двух антипараллельных цепей ДНК. Праймеры представляют собой два синтетических олигонуклеотида длиной в 20…30 нуклеотидов, каждый из которых комплементарен противоположной цепи ДНК в участках, ограничивающих выбранный сегмент ДНК возбудителя, т. е. праймеры ограничивают специфический для возбудителя участок ДНК. Праймеры добавляют в реакционную смесь в избытке, что позволяет им занять свои комплементарные участки до того, как произойдет соединение одноцепочечных ДНК в двухцепочечную. Длительность стадии 1…2 мин;
достройку праймера из внесенных в реакционную смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов при участии ДНК-полимеразы. Используют обычно термостабильную ДНК-полимеразу (Taq-полимеразу), что позволяет вести полимеризацию при оптимальной температуре 70…75 °С. При синтезе ДНК праймеры включаются в ее молекулу. Синтез ДНК с помощью полимеразы протекает только между праймерами, и при этом удваивается число копий именно этого участка ДНК. Длительность этой стадии 1…2 мин.
Таким образом можно провести несколько десятков циклов ферментативного удлинения праймеров, в результате количество сегментов ДНК, ограниченных с обеих сторон праймерами, с каждым циклом увеличивается экспоненциально. Следовательно, используя метод ПЦР, можно in vitro избирательно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в 1 000 000 раз и более. Факт увеличения числа фрагментов ДНК, т. е. ее амплификации, служит доказательством присутствия в исследуемом образце гомологичной ДНК — возбудителя инфекционной болезни.
Для практического использования ПЦР необходимо синтезировать праймеры, комплементарные концам цепей копируемой ДНК-матрицы и ограничивающие копируемый фрагмент ДНК. Их выбирают на основе участков генома возбудителя с расшифрованной нуклеотидной последовательностью и устойчивых к генетическим перестройкам.
Материалы и оборудование. 1. Водные растворы дезоксинуклеозидтрифосфатов (gНТФ) четырех типов (gАТФ, gТТФ, gГТФ, gЦТФ). 2. Первый праймер, второй праймер. 3. Фермент Taq-полимераза. 4. Амплифицируемая ДНК. 5. Ионы Mg2+для обеспечения работы полимеразы. 6. Буферный раствор (10-кратный концентрат), например трис-соляная кислота (pH 6,8…7,8) с добавлением бычьего альбумина и неионных детергентов. 7. Термоциклер.
В настоящее время выпускают коммерческие тест-системы для постановки ПЦР, которые включают указанные компоненты, а также дополнительные наборы для выделения ДНК из исследуемого материала и для проведения электрофореза. К каждой тест-системе прилагается инструкция.
Постановка реакции. Выделение ДНК. При использовании современных тест-систем для выделения ДНК применяется метод нуклеосорбции. Пробы вносят в пробирки с лизирующим раствором, добавляют сорбент, осаждают центрифугированием, несколько раз отмывают. В пробирки с сорбентом добавляют элюирующий буфер, перемешивают и центрифугируют. После такой обработки супернатант в пробирках содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.
Амплификация. Для проведения ПЦР требуется специальный прибор — термоциклер (амплификатор, программируемый термостат). Амплификация в нем осуществляется по заданной программе, прилагаемой к ПЦР-тест-системе. Применяют методику «горячего старта»: приготовление реакционной смеси из двух слоев, разделенных слоем парафина или воска. Нижний слой содержит праймеры с gНТФ, верхний слой — Taq-полимеразу. Сверху наслаивают минеральное масло. Затем в пробирку вносят исследуемую ДНК и помещают ее в амплификатор. При нагревании воск плавится, компоненты смешиваются, реакция начинается и далее продолжается полностью автоматически.
Детекция амплификонов. После завершения амплификации следует этап обнаружения продуктов ПЦР. Молекулы ДНК и их фрагменты разделяют электрофорезом в агарозном геле. Регистрацию фрагментов ДНК проводят по свечению в ультрафиолете в присутствии красителя (бромистого этидия), используя трансиллюминатор и регистрирующую компьютерную систему. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждают сравнением с контролями.
Практическое применение. Объектом исследования в ПЦР могут служить как материал, содержащий микроорганизм, так и чистые культуры возбудителя. Из материала обычно тем или иным способом извлекают ДНК. В зависимости от материала методы его обработки варьируют.
Ценность ПЦР-диагностики особенно возрастает, когда необходимо обнаружить возбудителей инфекционных болезней, или трудно культивируемых, например, микобактерий паратуберкулеза, хламидий, риккетсий и микоплазм, или находящихся в нетипичной форме (L-формы бактерий), а также выявить гены, контролирующие тот или иной фактор патогенности микроорганизма.
На кафедре микробиологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н. И. Вавилова ПЦР успешно используется для диагностики инфекционных болезней сельскохозяйственных животных и для индикации возбудителей в продуктах животноводства.
Доказаны (М. М. Додонов, 2002) возможность применения ПЦР для индикации возбудителя туберкулеза в образцах мяса и молока и ее существенные преимущества перед обычной методикой диагностики сельскохозяйственных животных на микобактерии туберкулеза. С помощью ПЦР при исследовании молока положительно реагирующих на туберкулин коров позитивные результаты получены в 25,3 % случаев, тогда как культуры М. bovis при параллельном исследовании изолированы не были. При исследовании 15 туш крупного рогатого скота с изменениями, характерными для туберкулеза, в 6 образцах при микроскопии мазков, окрашенных по Цилю—Нильсену, обнаружены туберкулезные палочки, выделено 4 штамма М. bovis, а метод ПЦР положительные результаты показал в 10 случаях.
ПЦР была апробирована (Л. В. Савельева, 1999) при исследовании экспериментально контаминированных Listeria monocytogenes проб молока: метод показал высокую чувствительность, специфичность. ПЦР (О. С. Ларионова, 2003) использовали для быстрой экспертизы с целью индикации L. monocytogenes в мясе и мясопродуктах. Всего было исследовано 54 образца: в ПЦР получено 27,77 % положительных результатов, бактериологически — 14,81 %. Все пробы, подтвержденные бактериологическим методом, оказались положительными в ПЦР.
Для индикации Y. enterocolitica в молоке (Е. С. Осипчук, 2003) была применена система «Иерсэнтеро амплитест» фирмы «Ниармедик-плюс»: ПЦР оказалась в 2 раза информативнее, чем бактериологический метод.
Исследовали (Т. В. Спиряхина, 2006) в ПЦР штаммы Y. enterocolitica, выделенные (З. Ю. Хапцевым) в разных районах Саратовской области от павших поросят и поросят с признаками диареи, а также культуры, изолированные (Е. С. Осипчук) из молока коров. Для определения патогенности этих культур применяли тест-систему «ДиаГен-Yersinia» для выявления фрагмента ДНК патогенных иерсиний («Диагенис», г. Москва). Праймеры этой тест-системы выбраны на основе нуклеотидной последовательности длиной 181 п. н., входящей в состав плазмиды вирулентности pYV. Положительные результаты получены с этой тест-системой лишь при исследовании Y. enterocolitica от больных поросят, но не из молока крупного рогатого скота. Это доказывает, что основным резервуаром кишечно-иерсиниозной инфекции являются свиньи.