Факультет

Студентам

Посетителям

Некоторые биохимические и биофизические аспекты процесса высушивания микроорганизмов

Вода относится к уникальным и незаменимым биологическим веществам, так как с особенностями ее структуры связаны три важнейших биологических эффекта: формирование пространственной структуры биологических макромолекул в растворе, самосборка различных надмолекулярных биологических структур, функционирование биологических структур (Аксенов, 1976).

Известно, что в клетке имеется свободная вода, в которой осуществляются многочисленные химические реакции, и связанная вода, входящая в состав макромолекул. В целом вода составляет 75—85% биомассы микроорганизмов. Преимущество гомойогидридных организмов по сравнению с пойкилогидридными состоит в наличии механизмов регулирования водного режима. Долгое время это положение не вызывало сомнений. С. И. Аксенов и др. впервые показали у некоторых представителей низших растений (в клетках лиофильно высушенных дрожжей разных систематических групп, конидиях меланинсодержащих грибов, лишайниках) присутствие подвижной изолированной воды, способствующей, по мнению авторов, регулированию у них водного режима. Такая вода постоянно сохраняется в организме и в условиях низких значений ОВВ (Аксенов, 1973, 1975, 1976; Николаев и др., 1975, 1977; Жданова и др., 1982). Количество подвижной изолированной воды у разных объектов колеблется от 1 до 20—30%. Сохранение воды в клетках изученных микроорганизмов авторы объясняют непроницаемостью клеточных мембран, возникающих в результате высушивания, вызывающего изменения конформации мембранных белков. Установлена прямая зависимость ксероустойчивости от количества подвижной изолированной воды в клетках криптококков и конидиях меланинсодержащего гриба Cladosporium transchelii и его цветных мутантов. Наличие этой воды в высушенных клетках, по всей вероятности, способствует более быстрому переходу организмов в состояние активного метаболизма. Таким образом, среди организмов, ранее считавшихся пойкилогидридными, обнаружен принципиально новый механизм удержания воды при высушивании. По нашему мнению, исследования в этом направлении следует расширить на большем количестве объектов. В настоящее время для некоторых грибов известно не два, а три состояния воды в клетке — свободная, связанная и подвижная изолированная.

С потерей клеткой 80—85% воды в ней остается связанная и подвижная изолированная вода. Дальнейшее снижение влажности приводит к постепенной потере связанной воды, и клетка переходит в состояние анабиоза. Последнее крайне важно для сохранения организма в неблагоприятных и экстремальных условиях существования (Бекер, 1967, 1972, 1978). Во многих случаях удаление связанной воды сопровождается нарушением барьерной функции мембран, вследствие чего изменяется активный транспорт калия, уменьшается активность ряда ферментов — некоторых фосфогидролаз, дегидрогеназ и др. Нарушенное высушиванием расположение фосфолипидов в мембранах облегчает доступ в клетку кислорода, вызывающего необратимое окисление клеточных структур.

При обезвоживании клеток немаловажен способ удаления из них воды. При использовании аэрозольного и эксикаторного методов вода с растворенными веществами направляется от центра к периферии клетки, при этом накапливается повышенное количество электролитов. Последние могут взаимодействовать с клеточными белками, вызывая их денатурацию (Ainsworth, Sussman, 1965; Бекер, 1967; Ehrlich et al., 1970). При лиофилизации, напротив, вода удаляется от периферии клеток к центру, и в результате нарушения цитоплазмы ячейкой мембраны создается возможность для проявления токсических свойств кислорода. Для жизнедеятельности клетки опасна потеря примерно 7/8 количества связанной воды, что соответствует так называемому критическому уровню влажности. У большинства изученных микроорганизмов он наступает при 33% абсолютной влажности, что соответствует 40—60%-ной ОВВ (aw = 0,4—0,6). В зависимости от выживаемости клеток в этом режиме влажности различают чувствительные микроорганизмы — Serratia marcescens, Escherichia coli и устойчивые — Bacillus subtilis, Pseudomonas gracilis, Torulopsis utilis, Candida tropicalis, Cladosporium transchelii, Stemphylium ilicis (Бекер, Упит, 1965; Бекер, Марауска, 1969; Webb, 1961а, с, Ehrlich et al., 1970; Жданова, Походенко, 1973). Показателем отношения микроорганизмов к заданному режиму влажности, кроме его роста и выживаемости, может быть потребление СО2. Так, Bacterium megaterium и Mycoccus ruber активно поглощали 14CO2 в условиях от 0,997 до 0,920 aw. Наибольшей устойчивостью отличался Aspergillus ruber, который фиксировал CO2 при значениях aw (активности воды) от 0,97 до 0,72—0,65, однако максимум потребления наблюдался при 0,92 aw (Imshenetsky et al., 1977).

При изучении важнейших биохимических процессов, происходящих во влажных, сухих и высушенных с добавлением защитных веществ клетках Escherichia coli, установлено, что в условиях 30%-ной влажности снижался уровень окислительных процессов и синтеза β-галактозидазы — показателя ненарушенности белкового синтеза в клетке (Webb, 1961а, с, 1966). Кроме того, резко увеличивалось окисление глюкозы у выживших после высушивания незащищенных клеток, что в сочетании с угнетением окисления аминокислот позволяет предположить нарушение энергетических обменных процессов. Последнее приводит к дезорганизации белкового синтеза и летальному исходу. К аналогичному выводу пришли Monk et al., (1957). По их данным, гибель высушенных клеток Serratia marcescens сопровождалась незначительным выделением энергии, что характерно для белковой денатурации.

Известно, что выживаемость лиофилизированных клеток при соприкосновении с воздухом резко снижается (Dewald, 1966; Белякова и др., 1967). Установлено защитное действие атмосферы азота на лиофилизованные Serratia marcescnes, S. capsularis, Pseudomonas aureofaciens и другие микроорганизмы (Lion, Bergman, 1961; Benedict et al., 1961; Anderson, Cox, 1967). Детальное исследование, проведенное на Е. coli и В. subtilis, высушенных в аэрозоле, показало, что процессы, связанные с удалением сорбционной воды из клетки и токсическим действием кислорода, по-разному проявляются при различной степени ее высушивания. (Hess, 1965; Webb, 1967). Состав атмосферы практически не оказывал влияния на выживаемость клеток, высушенных при ОВВ 90—50%. Степень устойчивости в этом случае определялась устойчивостью процессов белкового синтеза, которую можно усилить применением защитных веществ. Микробная биомасса, высушенная при ОВВ ниже 40%, была чувствительна к кислороду, негативное действие которого наблюдалось даже при концентрации его 0,25% в воздушной среде (Hess, 1965). Защитные вещества типа антиоксидантов снимали ингибирующее влияние кислорода. Cox (1968) наблюдал устойчивость различных штаммов лиофилизированных клеток Е. coli к кислороду.

Аналогичные результаты получены с помощью метода ЭПР (Dimnick et al., 1961; Lion et al., 1961; Heckly et al., 1963). В лиофилизированных клетках Saccharomyces cerevisiae, Sarcina lutea, Streptococcus lactis, Serratia marcescens отмечали слабые сигналы ЭПР, усиливающиеся по мере увеличения контакта с кислородом и не изменяющиеся в атмосфере азота и в вакууме. Таким образом, токсическое влияние кислорода установлено в физиолого-биохимических и биофизических экспериментах. В последние годы Strange, Cox (1976) предложили математическую модель кислородного поражения высушенных микробных клеток. Согласно этой модели, кислород взаимодействует с барьером X (цитоплазматическая мембрана), образуя соединение типа ХO2, которое в свою очередь может реагировать с акцептором А, окисляя его без особых последствий для клетки (АО2), или вызывать летальное окисление жизненно важных клеточных структур.

Губительное действие высушивания можно ослабить, используя защитные вещества. Все основные аминокислоты, бактопептон, пептон, портеаза увеличивают выживаемость клеток Е. coli, высушенных аэрозольным и эксикаторным методом (Webb, 1961а, 1966, 1967). Определенный защитный эффект наблюдался при высушивании клеток в присутствии глюкозы и маннозы, а также сахарозы и декстрина. Пентозы и нативные белки не обладали защитным действием. Высокотоксичными оказались хлориды, сульфаты, нитраты и нитриты, фенол, катехол, резорцин, гидрохинон, пирогаллол, полигидроксибензин. Защитное действие испытанных веществ уменьшалось прямо пропорционально влажности атмосферы и было наименьшим при 30%-ной ОВВ. Анализ химической структуры упомянутых защитных веществ заставляет думать, что их действие обусловлено аминогруппами белков и способностью спиртов замещать водные молекулы вокруг белков. Высоким защитным эффектом обладал 1%-ный раствор инозита. Механизм защитного действия его выяснен наиболее полно и состоит в способности инозита замещать удаляемую воду, так как энергия водородной связи его с белком приблизительно одинакова с таковой системы белок — вода (Webb, 1966). Защитным действием обладают также вещества типа антиоксидантов; ди- и трисахариды, глюкоза, тиомочевина, аскорбиновая кислота, хлористый аммоний, 1%-ный раствор ацетамида, гуанидин, глицерин и др. (Benedict et al., 1961; Lion, Avi-Dor, 1963; Anderson, Cox, 1967; Cox, 1968). Активность этих веществ проявлялась при ОВВ ниже 40%. При более высокой влажности они, за исключением инозита, не проявляли защитного действия. Защита от избыточной сухости воздуха и субстрата с помощью таких веществ осуществляется только после диффузии их в клетку (Lion, 1963). Эти сведения подтверждают предположение о неодинаковых причинах гибели микроорганизмов при умеренном и интенсивном высушивании. Показана возможность защиты лиофилизированного микробного материала (клетки дрожжей, бактерий, культуры тканей) от токсического действия кислорода применением иминоксильных радикалов в концентрации 10-2 М (Кравцов, 1977).

В атмосфере кислорода неблагоприятное действие высушивания и ионизирующей радиации усиливается (Hess, 1965). Основанием для заключения о сходном влиянии кислорода при действии каждого из перечисленных факторов послужил одинаковый защитный эффект тиомочевины и глицерина при облучении и высушивании Е. coli.

Таким образом, процесс высушивания приводит к глубоким структурным нарушениям в микробной клетке, связанным с удалением свободной и связанной воды, а при интенсивном высушивании — с повышением проницаемости клеточных мембран. Применяя защитные вещества, можно ослабить, а в некоторых случаях и полностью снять отрицательное действие избыточного высушивания.

Источник: Н. Н. Жданова, А. И. Василевская. Экстремальная экология грибов в природе и эксперименте. Киев: Наук. думка, 1982

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: