Клейковину получают из пшеничной муки или ее белковых компонентов с помощью отмывания, поэтому возникает вопрос, находится ли она в зерне пшеницы уже в готовом виде или образуется непосредственно в процессе замеса теста и отмывания.
Один из первых исследователей клейковины Пармантье (цит. по Осборну, 1935) считал, что она находится в зерне пшеницы в готовом, но обезвоженном состоянии, и при соприкосновении с водой происходит лишь ее гидратация, ведущая к получению сырой клейковины. Позднее появился взгляд, что в зерне и муке содержится не клейковина, а некоторое исходное белковое вещество, которое при увлажнении превращается в клейковину в результате реакции, катализируемой особым ферментом.
Ферментативная гипотеза образования клейковины была впервые высказана Вейлем и Бишоффом в 1880 г. Указанные исследователи считали, что специфический фермент действует при увлажнении муки на содержащийся в ней глобулин («растительный миозин»), превращая его в клейковину. Обоснованием этой гипотезы служили опыты авторов, показавшие, что клейковину не удается отмыть после экстрагирования муки 15%-ными растворами NaCl и Na2CO3, извлекающими глобулины, а также после коагуляции последних с помощью нагревания муки. Ферментативная гипотеза образования клейковины была поддержана Кьельдалем, в опытах которого наблюдалась зависимость выхода клейковины от температуры воды, применявшейся для отмывания, причем указанная зависимость выражалась кривой, характерной для ферментативных реакций. При нуле клейковину отмыть не удавалось, с повышением температуры воды до 40° выход ее увеличивался и достигал максимума, а в дальнейшем вновь резко снижался. Кроме того, было показано, что соли ртути и других тяжелых металлов даже в очень малых количествах препятствуют получению клейковины, инактивируя, по мнению автора, гипотетический фермент.
Позднее А. И. Опарин (1929) и В. С. Садиков (1935) поддержали ферментативную гипотезу образования клейковины, предположив, что этот процесс основан на свертывании белков пшеницы под влиянием особого фермента, подобного тромбазе, свертывающей белки крови. Никаких экспериментальных данных в обоснование указанной гипотезы приведено, однако, не было. Между тем многие авторы выдвинули ряд обоснованных возражений против предположения о ферментативной природе образования клейковины в процессе увлажнения муки.
Еше в 1888 г. Иоганнсен (по Nasinith, 1904) пытался доказать, что нагревание муки, а также добавление к ней кислоты, сулемы и т. п. приводят к невозможности отмыть клейковину в результате денатурации белков, а не инактивации особого фермента, поскольку искусственная смесь сухой измельченной клейковины и крахмала, способная при отмывании образовать сырую клейковину, ведет себя при воздействии этих факторов совершенно аналогично муке, хотя никакого фермента для синтеза клейковины в случае смеси заведомо не требуется, так как она уже включает в себя готовую и лишь обезвоженную клейковину. На основании своих опытов Иоганнсен пришел к выводу, что пшеничное зерно содержит готовую клейковину в тонко распределенном и обезвоженном состоянии.
Насмит (Nasmitb, 1904) добавлял к муке, клейковина которой была разрушена прогреванием, небольшое количество свежей муки в качестве источника фермента, после чего вновь пытался отмыть клейковину. Результат оказался отрицательным, и это привело автора к выводу об отсутствии специфического фермента в исследованном материале. Против ферментативной гипотезы образования клейковины выступили также Бэкер и Хальтон (Baker, Hulton, 1908), с успехом отмывавшие клейковину из теста, содержащего медный купорос, хлорид ртути или соляную кислоту, добавляемые для инактивации предполагаемого фермента.
Что же касается данных Кьельдаля, то они не подтвердились другими исследователями. Так, Баллан (цит. По Козьминой, 1935) показал, что отмывание при температуре воды + 2°, +15° и +60° приводит к получению одинаковых количеств клейковины. Тот же результат был получен В. Л. Кретовичем (1938) в опытах по отмыванию клейковины при 0° и при комнатной температуре.
Следует отметить, что прямую экспериментальную проверку ферментативной гипотезы образования клейковины осуществить трудно, так как все способы инактивирования предполагаемого фермента оказывают одновременно денатурирующее действие и на белки пшеницы. А. Б. Вакар (1952) попытался выяснить вопрос о наличии в нормальном зрелом зерне специфического фермента, образующего клейковину, действуя водной вытяжкой такого зерна на муку из недозрелой пшеницы (в фазе ранней молочной спелости), где клейковина еще не могла быть отмыта, хотя составляющие ее белки — глиадин и глютенин — уже содержались в достаточном количестве. Было приготовлено тесто из бесклейковинной муки незрелого зерна и водной вытяжки нормальной пшеницы. Осторожное и тщательное отмывание не привело к получению клейковины из этого теста, чем вновь подтвердилась несостоятельность ферментативной гипотезы образования клейковины. В настоящее время эта гипотеза совершенно оставлена, так как экспериментальных оснований она не имеет.
Большинство исследователей рассматривает образование Сырой клейковины как коллоиднохимический процесс набухания и агрегации белковых веществ зерна. А. И. Гершзон (1976) отметила наличие двух основных точек зрения по этому вопросу. Согласно одной из них, зерно содержит отдельные белки (глиадин и глютенин) в свободном состоянии. При увлажнении муки эти белки гидратируются и вступают во взаимодействие, образуя комплекс. Таким образом, клейковина формируется непосредственно во время приготовления теста.
Согласно второй точке зрения, клейковина «предсуществует» в зерне в виде низкогидратированного комплекса связанных между собой белковых веществ, образующих единое целое. При увлажнении муки происходит лишь гидратация этого комплекса и соединение отдельных частиц его в связную массу «сырой клейковины».
Следует отметить, что подавляющее большинство исследователей придерживается второй из упомянутых точек зрения. Так, еще в старых работах Берлинера и Коопмана (Berliner, Koopmann, 1929), Борга (Borg, 1929), Mooca (Mohs, 1931), Бейли (1933), Неймана (1935), Козьминой (1935) и других авторов была отчетливо высказана мысль о существовании в эндосперме пшеницы обезвоженного клейковинного белка как единого целого. Противоположное представление о формировании клейковины из находящихся в зерне отдельных белков (глиадина и глютенина) лишь в процессе увлажнения муки и приготовления теста было высказано в предположительной форме Свансоном (Swanson, 1925) и позднее поддержано Тестони (цит. по Kent-Jones, 1929), но не получило дальнейшего развития.
В настоящее время не приходится сомневаться в том, что в эндосперме пшеницы находятся не отдельные белковые вещества, например глиадин и глютенин, но именно обезвоженная клейковина как единое целое. Если встать на противоположную точку зрения и считать, что клейковина формируется из глиадина и глютенина только в процессе приготовления теста, то становится непонятным, почему она не образовалась в эндосперме созревающей пшеницы в фазе восковой спелости, когда влажность зерна соответствовала влажности теста (около 40%), а синтез глиадина и глютенина был уже практически завершен.
Опыт показывает, что действительно в фазе восковой спелости зерно содержит сырую клейковину, которую нетрудно обнаружить при простом раздавливании зерна в виде заметных на глаз характерных, упругих тяжей. Так как нет никаких оснований предполагать, что клейковина, находящаяся в зерне в период восковой спелости, будет при дальнейшем естественном высыхании его распадаться на составные части, то, очевидно, по окончании созревания эндосперм должен содержать частицы сухой клейковины, способные к повторной гидратации и слипанию в общую массу сырой клейковины.
Приведенные соображения получили прямое подтверждение в наших опытах (Вакар, 1949, 1952), в которых с помощью фракционирования белковых веществ созревающей пшеницы различными растворителями было показано, что с самого начала налива зерно не содержит отдельных белковых фракций в свободном состоянии. Глиадин и глютенин по всему ходу созревания зерна связаны в некоторый комплекс, частицы которого способны набухать и слипаться, образуя при отмывании сырую клейковину. И. Ш. Шкловский (1955) на основании своих опытов о влиянии этилового спирта на процесс отмывания клейковины из муки также пришел к заключению, что в эндосперме пшеничного зерна содержатся не отдельные белки — глиадин и глютенин, а частицы сухой клейковины, состоящие из этих белков.
Еще в 1929 г. Берлинер и Коопман (Berliner, Koopmann), .а также Борг (Borg, 1929) указывали на возможность наблюдать клейковину под микроскопом непосредственно на срезах зерна. В недавнее время эти данные получили подтверждение и дальнейшее развитие в работах Гесса и Козьминой. С помощью оптической, ультрафиолетовой и электронной микроскопии Гесс, а затем Козьмина детально исследовали общий вид и микроструктуру белка непосредственно в эндосперме пшеницы и показали существование двух белковых фракций — цвикельпротеина (промежуточный белок) и хафтпротеина (прикрепленный белок). Как подробно описывалось выше, цвикельпротеин, будучи выделен из муки в виде препарата, легко набухает в воде, образуя типичную сырую клейковину. Н. П. Козьмина (1959) считает, что «промежуточный белок представляет собой то нативное вещество, в результате гидратации которого образуется клейковина». Это определение следует уточнить в том отношении, что цвикельпротеин (промежуточный белок) включает в себя клейковинный белок, но не идентичен с ним, так как препараты цвикельпротеина содержат также заметные количества водо — и солерастворимых белков, не участвующих в формировании клейковинного студня и удаляемых при его отмывании. Цвикельпротеин следует рассматривать как суммарный белок, находящийся в эндосперме пшеницы в промежутках между крахмальными зернами и включающий в себя собственно «клейковинный белок», т. е. то белковое вещество, частицы которого способны набухать, слипаться и формировать связную массу сырой клейковины. При этом, разумеется, сам факт микроскопического наблюдения цвикельпротеина в клетках эндосперма и выделение его в виде очищенного препарата еще ничего не говорит о том, представляет ли он смесь свободных белков, в частности глиадина и глютенина, или же последние соединены в некоторый комплекс, как это можно предполагать по другим данным и соображениям, рассмотренным выше.
Гесс (Hess, 1952, 1953, 1954) провел сравнительный рентгеноетруктурный анализ «нативного» белка пшеницы (цвикельпротеина) в сухом и набухшем состоянии, а также сырой и сухой клейковины из той же муки и пришел к выводу о коренных различиях в структуре «нативного» белка и клейковины.
Приведенные данные показывают, что «нативный» белок при набухании в воде без механического воздействия увеличивает значение d от 42—44 А приблизительно до 90 А, причем этот процесс является обратимым. Под влиянием механического воздействия (замеса) набухший
Цвикелыпротеин превращается в сырую клейковину, что сопровождается изменением структуры белка, причем величина d падает с 90 до 55 А. Одновременно происходит дополнительная гидратация белка, поскольку увеличение объема при набухании для цвикельпротеина составляет около 25%, а для клейковины — 200%. Процесс превращения цвикельпротеина в сырую клейковину необратим. При обезвоживании сырая клейковина обратимо переходит в сухую клейковину с величиной d порядка 43—47 А. Сухая клейковина не идентична сухому цвикельпротеину, так как при увлажнении она превращается в сырую клейковину с d, равным приблизительно 55 А, а не в набухший цвикельпротеин, для которого d составляет около 90 А.
Трудно было бы, конечно, ожидать полной идентичности сухой клейковины и первоначального «нативного» цвикель-протеина, так как в процессе получения сухой клейковины исходный белок муки не только подвергается гидратирова — нию, механическому воздействию и повторному обезвоживанию, т. е. обработке, способной изменить его структуру, но изменяется и общий состав суммарного белка вследствие удаления альбуминов и глобулинов при отмывании клейковины. Правда, Гесс не указывает способ получения им сухой клейковины и потому не ясно, отмывал ли он набухший цвикельпротеин или нет и какова была методика обезвоживания сырой клейковины.
На основании приведенных данных Гесс пришел к заключению, что в эндосперме зерна содержится нативный сухой белок, способный превращаться в клейковину, но не идентичный по своей структуре с обезвоженным клейковинным белком. Самый процесс превращения нативного белка пшеницы в клейковину сопровождается необратимой денатурацией его, которая является следствием не гидратации, а механического воздействия при замесе и отмывании клейковины.
Последующие работы Гесса (Hess, 1954) привели, однако, к существенному изменению этих представлений. Оказалось, что рентгеновская интерференция сырой клейковины, отмытой из предварительно обезжиренной муки, характеризуется величиной d, равной не 55 А, как указывалось выше, а 90 А, т. е. структура клейковины не отличается от структуры гидра — тированного цвикельпротеина, набухшего без механического воздействия (без замеса). Отсюда следует, что при отмывании клейковины из обычной необезжиренной муки необратимое изменение структуры исходного белка является результатом не механического воздействия на него, а присоединения жировых веществ, которые, как это показали ранее Олкот и Мичем (Olcott, Mecham, 1947), образуют прочный комплекс с набухшими белками клейковины и не могут быть извлечены обычными растворителями свободных жиров. Связывание жировых веществ при образовании сырой клейковины не отражается, однако, заметным образом на рентгеновской интерференции сухой клейковины, для которой, как отмечалось выше, d имеет почти ту же величину, что и для сухого цвикельпротеина (43—45 А).
Все эти вопросы пока еще не выяснены и требуют дальнейших исследований, так как несомненно, что не только присоединение жировых веществ, но и гидратация, механическое воздействие и обезвоживание в той или иной степени влияют на структуру исходного белка. Все же в свете современных знаний можно с достаточной определенностью утверждать, что нативный белок, находящийся в эндосперме пшеничного зерна, представляет собой в принципе обезвоженный клейковинный белок, сохраняющий характерные особенности своей структуры и в препаратах клейковины, хотя, несомненно, процесс приготовления этих препаратов не может не сопровождаться частичными изменениями свойств исходного белка, т. е. некоторой его денатурацией.