Факультет

Студентам

Посетителям

Микробиологическое разложение гербицидов

Процессы деградации гербицидов микроорганизмами в природе имеют существенное значение в связи с их участием в превращении продуктов, загрязняющих окружающую среду.

Актуальность проблемы возрастает вследствие того, что частичные превращения гербицидов микроорганизмами в природных условиях могут привести к накоплению в разных участках биосферы веществ с новыми свойствами, значительно отличающимися от исходных соединений. В результате на определенных путях трансформации могут возникнуть вещества более токсичные, чем исходные.

Микробиологическая трансформация гербицидов по своей природе не представляет собой чего-либо специфического и так же, как микробиологическая трансформация органических соединений, в широком смысле включает три класса процессов ферментативной химии. К первому можно отнести превращения веществ ферментами микроорганизмов и накопление продуктов этих превращений, являющихся результатом искусственного нарушения нормального метаболизма микробной клетки. Ко второму классу микробиологической трансформации относят накопление промежуточных продуктов в процессе нормального развития микробных культур. Наконец, типичной трансформацией является накопление частично превращенного субстрата, который не метаболизируется в нормальных физиологических условиях.

По мнению Л. А. Головлевой с соавторами, возможны два подхода к практическому использованию микроорганизмов для детоксикации стойких соединений, попадающих в биосферу: применение селекционных штаммов для осуществления полного разложения или трансформации исходной молекулы и мобилизация ферментативных возможностей микрофлоры естественных субстратов.

Первоначальные работы, направленные на изучение действия микроорганизмов на гербициды, были посвящены выявлению самого факта их детоксикации активной микрофлорой. Целевые поиски показали, что большое количество почвенных микроорганизмов способно атаковать гербициды самой различной природы и трансформировать их в разной степени. Успех в этом направлении можно продемонстрировать перечнем культур, способных превращать молекулу 2,4-Д. Микроорганизмы, способные к разложению 2,4-Д, идентифицированы как Bacterium globiformey Flavobacterium agualite, Pseudomonas sp., Corynebacterium sp., Mycoplana sp., Arthrobacter sp., Aspergillus niger, Achromobacter sp. Почвенная микрофлора осуществляет в основном детоксикацию гербицидов в почве. Благодаря балансовому опыту, проведенному М. С. Соколовым с сотрудниками, удалось выяснить, что 80—85% пропанида, находящегося на рисовом чеке (в почве и воде), подвергалось гидролизу и разложению почвенными микроорганизмами и энзимами; 6% — фоторазложению; 3—4% разлагалось растениями; 1% был подвержен гидролизу и окислению. Распад параквата в почве осуществляется преимущественно дрожжевыми грибами Lypomyces starkeyL Дикват в этой же почве подвергался деструкции Pseudomonas sp. Паракват в почве могут разлагать также Corynebacterium fascians, Clostridium pasteurianum. При исходной концентрации 10 мг/л под действием этих микроорганизмов он разлагался на 20—40%.

Результаты изучения превращений пиразона в почве, приведенные в работе О. И. Романовской, показывают, что гербицид подвергается в почве частичному распаду, осуществляемому микроорганизмами. Одним из аргументов в пользу участия микроорганизмов в процессах детоксикации агрохимикатов в естественных условиях считают увеличение скорости разложения гербицидов после повторных обработок ими почвы. Предполагается, что при этом происходят отбор, адаптация и накопление микроорганизмов, способных метаболизировать внесенные в почву гербициды, что связано с некоторым лаг-периодом при первичной обработке и отсутствием его при повторных. Установлено участие микроорганизмов в разложении симазина, пропинола и нитрофена в почве. Опыты по распаду симазина показали, что этот гербицид успешно разлагают низшие грибы следующих родов: Aspergillus, Fusariut, Penicillium, Rhizopus, Stachybotrys, Trichoderma, Streptomyces, Arthrobacter. Aspergillus fumigatus разлагал симазин за 12 дней почти полностью.

Микробиологическое разрушение 2,4-Д в естественных водоемах затруднено. Это подтверждается данными о том, что 60% 2,4-Д сохранялось в водоеме в течение 3—8 мес. Результаты лабораторных исследований действия микроорганизмов на гербициды, как правило, не удается повторить в природных условиях. В частности, искусственное внесение культур, активно разлагающих гербицид ордрам в лабораторных условиях, оказалось неэффективным в естественных водоемах.

Разложению гербицидов 2,4-Д и 2М-4Х под влиянием почвенных микроорганизмов посвящены многие работы. При сравнительном изучении их поведения в почве установлено, что под действием микроорганизмов 2,4-Д распадается значительно быстрее, чем 2М-4Х. Возможны два варианта механизма действия микробов на гербициды: первый — появление спонтанных мутаций в почвенных популяциях, второй — индукция адаптивных энзимов, вызванная внесением гербицидов.

Важное место в разложении и детоксикации гербицидов отводится исследователями структуре самого вещества. Хлорзамещенные феноксиуксусные кислоты наиболее устойчивы к микробиологическому разложению, тем не менее и они разлагаются почвенной микрофлорой за сравнительно короткий срок.

Хлорзамещение в парапозиции 2,4-Д делает молекулу более подвижной, и ее метаболизм осуществляется за минимальное время. Орто — и метапозиция деактивируют молекулу, и разложение гербицида в дозе 10 мг/кг длится дольше 2 месяцев. P. Wing и К. Kaiser при изучении бактериального расщепления полихлористых дифенилов установили, что нехлорированные дифенилы расщепляются с большой скоростью. Среди активных штаммов бактерий ими было идентифицировано 5 культур, принадлежащих роду Pseudomonas, и 2 — роду Achromobacter. Алахлор под действием этих микроорганизмов полностью расщепляется до низкомолекулярных продуктов через месяц. Предполагается, что скорость расщепления дифенилов зависит не только от присутствия атомов хлора, но и от положения хлора в молекуле бензольного кольца.

Виды Pseudomonas и Nocardia способны с легкостью усваивать а-монопропионовую кислоту, метаболизм у-кислот значительно затруднен. Nocardia и Pseudomonas адаптируются к разложению бромсодержащих веществ быстро, а йодсодержащих — медленно. Эти различия могут быть обусловлены спецификой их ферментных систем.

Разрушение гербицидов микрофлорой зависит от активности энзимов микробной популяции и приспособляемости микроорганизмов к препаратам. Из культур Pseudomonas выделен фермент, который при инкубировании разлагал хлорсодержащие соединения до аминов и хлоранилинов.

При изучении метаболизма 2,4-Д и 2М-4Х штаммами Achromobacter sp. установлено, что молодые бактериальные культуры были активны в большей степени, чем старые в процессе окисления субстратов. Адаптированные микроорганизмы разлагали 2,4-Д через 2,4-дихлорфенол-4-катехол, а 2М-4Х — через 5-хлоро-2-крезол. Бактерия, растущая на 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоте, не окисляла ни один из 5 возможных изомеров. Однако адаптация микроорганизмов к этим (и другим) препаратам ограничена определенными пределами, при превышении которых разложение гербицида прекращается.

Важный этап в исследованиях действия микрофлоры на гербициды — установление возможности использования их микроорганизмами в качестве единственного источника углерода и азота.

На современном этапе науки основное внимание исследователей было направлено на выявление метаболических путей разложения гербицидов, накопление продуктов распада и изучение их свойств. Особое внимание уделялось процессам трансформации гербицидов микробными культурами, развивающимися за счет использования других соединений, которые служат источниками питания и энергии. Подобные процессы называются соокислительными или кометаболическими. Одна из особенностей кометаболических реакций состоит в том, что в них трансформация происходит сопряженно с процессом окисления ростового субстрата.

Трансформация некоторых гербицидов осуществляется микроорганизмами, растущими на среде с соединениями (косубстратами), которые представляют собой структурные аналоги этих веществ, но в отличие от них могут служить источником углерода и энергии для определенных микроорганизмов. Например, 20 культур бактерий, представленных 9 родами: Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter, Flavobacterium, Achromobacter, Brevibacierium, Microbacterium, Micrococcus, Xanthomonas, способны разлагать один или более из 22 замещенных бензоатов.

Характер связи между процессами окисления ростового и трансформируемого субстратов может быть значительно сложнее, чем простая индукция трансформирующей системы ростовым субстратом. Часто структура разлагаемого соединения не имеет аналогии с ростовым субстратом. Существует несколько механизмов, обусловливающих влияние природы ростового субстрата на возможности микроорганизмов. Использование метода кометаболизма позволило повести микробиологическую атаку на гербициды, ранее считавшиеся недоступными ферментам микроорганизмов: 2,3,6-ТБК, 2,4,5-Т. При осуществлении кометаболизма смесью культур или целой серией кометаболических реакций эти гербициды могут быть полностью разрушены. Кометаболическое разложение хлорбензоата усиливается внесением глюкозы как косубстрата. При этом глюкоза способствует росту микроорганизмов и их активности в разложении гербицида, а также увеличивает число ароматических составляющих при разложении.

Л. А. Головлевой и сотр. удалось кометаболизировать ордрам в соокислительных условиях. При внесении дополнительных косубстратов (этанол, сахароза, ксилоза, глюкоза) этот процесс осуществляли культуры Pseudomonas, Nocardia, Mycococcus, Bacillus, выделенные авторами из природных источников. Отмечается, что процесс деградации ордрама у разных культур отличается по скорости, степени деградации и накоплению промежуточных продуктов. Внесенный в водоем косубстрат играл двойную роль: стимулировал развитие определенной группы бактерий и в роли собственно косубстрата обеспечивал функционирование ферментных систем, атакующих ордрам.

Г. К. Скрябин и Л. А. Головлева обнаружили ряд штаммов, способных разрушать в соокислительных условиях алвисон-8, 2М-4Х и ДДТ. Эффективными косубстратами были соединения, активно метаболизируемые микроорганизмами, но не способные поддерживать активный рост. В некоторых случаях культуры росли за счет косубстрата; тогда процесс имел двухстадийный характер: деградация осуществлялась в начальный период, предшествуя фазе активного роста. В качестве косубстрата использовались алканы от С8 до Ci7, а также органические кислоты — уксусная, пропионовая, лимонная и глюкоза.

Изучение кометаболических преобразований гербицидов имеет не только большую практическую ценность, но и существенное теоретическое значение в познании закономерностей взаимодействия микроорганизмов с несколькими субстратами.

В наших исследованиях большое внимание уделено вопросам разрушения гербицидов 2М-4Х, прометрина, симазина микрофлорой торфяных почв. Началом работы был поиск микроорганизмов, использующих эти гербициды в качестве источников питания. В результате исследований с 1976 по 1978 г. выделены из образцов торфяно-болотных почв 292 культуры микроорганизмов: на MCA—33; МПА-81; КАА—78; СА—10; Е-8 — 90. Анализ литературы приводит к бесспорному выводу о главенствующей роли почвенной микрофлоры в детоксикации и трансформации гербицидов. Для выявления микроорганизмов, способных проводить трансформацию того или иного гербицида, необходимо вначале отобрать штаммы, интенсивно использующие трансформируемый субстрат в качестве ростового вещества.

Современная методология микробиологической трансформации позволяет использовать для химического превращения любой микроорганизм. Это выражение потенциальных возможностей микрофлоры. В первую очередь находят применение в качестве культур-трансформаторов сапрофитные микроорганизмы, способные развиваться на сравнительно простых средах; затем — гетеротрофы, отличающиеся интенсивным обменом веществ.

Круг микробов-трансформаторов включает в себя представителей грибов, актиномицетов, многих семейств бактерий.

Из 202 микроорганизмов, выделенных в 1976—1977 гг., 103 культуры выращивали на жидкой минерально-солевой среде Е-8, в составе которой в качестве единственных источников углерода присутствовали гербициды 2М-4Х и прометрин в концентрации 300 мг/л.

В вариантах с 2М-4Х способность к росту выявлена у 39 культур. Использование сахарозы и глюкозы в качестве косубстратов позволило мобилизировать ферментативные возможности на использование 2М-4Х еще у 9 культур микроорганизмов. В варианте с сахарозой в качестве косубстрата в присутствии 2М-4Х росли культуры 21п, 134с, 141с; 6 культур зафиксированы в варианте с глюкозой.

Из 40 культур микроорганизмов, растущих на прометрине, 28 не нуждались в косубстрате, 12 культур росли только при наличии в среде сахарозы и 2 микроорганизма предпочли в качестве косубстрата глюкозу.

В 1978 г. сразу же после выделения культур микроорганизмов проведена их проверка на способность к росту на среде, содержащей 2М-4Х. Из выделенных на МБС в мае 22 культур 18% микроорганизмов проявили способность к росту на жидкой среде с содержанием 2М-4Х. В июле уже 50% из выделенных на этом же участке культур микроорганизмов интенсивно росли на жидкой среде с гербицидом. По всей вероятности, с течением времени почвенная микрофлора адаптируется к присутствию внесенной 2М-4Х; мобилизовав свои ферментативные возможности, она начинает использовать гербицид в качестве источника питания. Уменьшение количества 2М-4Х в почве в августе привело к снижению на этом участке и числа активных к использованию гербицида культур микроорганизмов. Из 14 культур, выделенных в августе на МБС, только 28% микроорганизмов росли на жидкой среде, содержащей 2М-4Х.

На ПОБС в июле было выделено 8 культур, из которых 5 хорошо росли на жидкой среде с 2М-4Х; из 10 культур, выделенных в августе в совхозе «Ведрич», только 3 использовали гербицид в качестве источника углерода.

Резюмируя сказанное, можно заключить, что из 64 культур, выделенных в 1978 г., 20 микроорганизмов хорошо росли на минерально-солевой среде Е-8, содержащей 2М — 4Х в концентрации 300 мг/л.

В 1979 г. микроорганизмы, использующие 2М-4Х в качестве источника питания, выделяли из накопительных культур, их число составило 26.

Полученная нами в результате проведенной работы коллекция микроорганизмов, выделенных из образцов торфяно-болотных почв, включает в себя 94 культуры, использующие 2М-4Х, и 42 микроорганизма, растущих на среде с прометрином в концентрации 300 мг/л.

Для изучения деградации 2M-4X в почвенных образцах 100 мл минеральной среды Е-8, содержащей 150 мг/л 2М — 4Х, инокулировали 1 г торфяной почвы и помещали на качалку при температуре 28 °С на 30 дней. Учет убыли 2М-4Х проводили ежедневно методом, описанным Whiteside и Аlеxander в 1960 г. на спектрометре в ультрафиолетовой области спектра.

Схема опыта:

а) среда инокулирована торфяной почвой, в которую в процессе сельскохозяйственного использования не вносился гербицид 2М-4Х;

б) среда инокулирована торфяной почвой, в которую в течение 3 лет вносили 2М-4Х в количестве 1,5 кг/га.

По истечении 30 дней проведены высевы на среду Е-8 с 2М-4Х для выделения микроорганизмов в чистую культуру. Полученные чистые культуры микроорганизмов смывом с косяка засевали в минерально-солевую среду Е-8, содержащую 2М-4Х, в количестве 200 мг/л для учета интенсивности разложения гербицида чистой культурой. Опыт проводили в колбах (500 мл) с объемом среды 200 мл в течение 30 дней на качалке при температуре 28 °С.

В варианте с почвой, в течение 3 лет обрабатываемой 2М-4Х, 12 дней отмечалось незначительное снижение количества гербицида. В последующие 2 дня (13—14-е сутки) произошло резкое падение содержания 2М-4Х — почти до 0.

Видимо, первые 12 суток — это период подготовительного метаболизма, который закончился бурным разложением 2М-4Х микрофлорой, содержащейся во внесенной в среду почве.

В варианте с почвой, не подвергавшейся ранее обработкам 2М-4Х, период подготовительного метаболизма был более растянут и составил 12 суток. За последующие 10 дней из внесенных в среду 150 мг 2М-4Х было разложено 68 мг.

Таким образом, не только период подготовительного метаболизма, но и сам процесс разрушения 2М-4Х в данном варианте значительно длиннее, чем в предыдущем. Это, вероятно, связано с адаптацией ферментативного аппарата микрофлоры почвы, регулярно обрабатываемой 2М-4Х, к усвоению гербицида в качестве одного из ростовых субстратов. Микроорганизмы, выделенные из этого варианта в чистую культуру, при выращивании на среде, содержащей 2М-4Х в качестве единственного источника углерода, разлагали гербицид с различной интенсивностью.

Из 8 культур Pseudomonas и 2 культур Arthrobacter Ps. viciae 27п, Ps. rubra 18n, Arthrobacter tumescens 17 с не разрушали гербицид в течение 30 дней эксперимента. Самой интенсивной убыль 2М-4Х была в варианте с культурой Pseudomonas xanthe 49п. Культура начала разрушать гербицид после 10 суток подготовительного метаболизма, и к 30-му дню наблюдений из 200 мг 2М-4Х, внесенных в среду, 132 мг было разложено.

Убыль гербицида из среды в вариантах с культурами Ps. viciae 25п, Ps. gracilis lc, Arthrobacter, globiforme 165c составила на 30-е сутки соответственно 40, 60 и 79 мг. Следовательно, ни одна из выделенных культур не разлагала 2М-4Х в чистой культуре с той интенсивностью, с которой гербицид был разложен в опыте с инокуляцией среды почвой. По-видимому, при добавлении в среду почвы в ней создаются условия для кооперативных действий смеси культур комменсализма или возникает возможность использования микроорганизмами дополнительных субстратов, активирующих ферментные системы микрофлоры, что обеспечивает скорейшее разложение гербицида 2М-4Х.

Скорость разложения гербицида прометрина прослеживали по убыли его из среды методом тонкослойной хроматографии. Экстракцию прометрина из среды проводили я-гексаном. В качестве подвижного растворителя использовали смесь гексана и ацетона в соотношении 4:1.

Пятна прометрина отмечали на пластинах при опрыскивании проявляющим раствором бромфенолового синего и азотнокислого серебра. Количественное определение проводили путем визуального сравнения интенсивности окраски и размера пятен пробы и стандартов. Опыт проведен на среде Е-8 с внесением прометрина 300 мг/л.

Опытные культуры микроорганизмов выращивали в колбах емкостью 750 мл с объемом среды 300 мл. Проба для экстракции прометрина составляла 200 мл культуральной жидкости. Убыль прометрина методом хроматографии в тонком слое учитывали периодически в течение 12 суток (5 определений). Повторность опыта трехкратная.

Из микроорганизмов, выделенных в чистую культуру, культуры Mycobacterium flavum 2с и Pseudomonas pictorum 131с хорошо росли на среде, содержащей 300 мг/л прометрина. Исследованием динамики убыли прометрина из среды, на которой выращивали указанные культуры микроорганизмов, установлено, что обе культуры разлагают прометрин в сравнительно близкие сроки, но с различной интенсивностью в первые дни роста. Убыль прометрина из культуральной жидкости на 6-е сутки культивирования составила для культуры 2с 50 мг; в варианте с культурой 131с—100 мг из 200 мг, внесенных в среду. В обоих вариантах к 12-м суткам оставалось около 75— 60 мг гербицида в расчете на 1 л среды. С несколько большей скоростью обе культуры разлагали прометрин в вариантах с использованием сахарозы в качестве косубстрата, особенно в первые 6 суток. К этому времени в среде содержалась лишь половина внесенного гербицида. Очевидно, использование культурами микроорганизмов косубстрата ускоряет начало атаки на молекулу прометрина. В оставшиеся 6 суток эксперимента обе культуры разложили вдвое меньше гербицида, чем в первые.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: