Комплекс условий, необходимых для фиксации азота синезелеными водорослями, показывает, что физиология азотфиксации у Cyanophyta та же, что и у других азотфиксаторов.
После открытий Бурриса и Вильсона, показавших, что азот — фиксирующая активность специфически ингибируется водородом и окисью углерода как у Rhizobium и Azotobacter, так и у Nostoc muscorum, получены многочисленные подтверждения идентичности энзиматических систем, управляющих азотфиксацией у водорослей и у бактерий.
Изучение механизма биологической азотфиксации имеет особый интерес. Химически инертная молекула N2 вступает в быстрые реакции синтеза при обычных температурах и давлении, что пока не достигнуто в химической индустрии.
Общность механизма азотфиксации у водорослей и других микроорганизмов сделала синезеленые перспективными объектами для изучения общих закономерностей биологической фиксации азота. Вместе с тем сочетание азотфиксации и фотосинтеза у синезеленых вызывает специфический интерес к этим организмам, поскольку они показывают наиболее прямой способ использования солнечной энергии для обеспечения растений доступным азотом.
Изучение соотношения фотосинтеза и азотфиксации было предпринято Фоггом. Отмечается, что у синезеленых, как и у фотосинтезирующих бактерий, нет каких-либо особенностей фотосинтеза, которые могут быть специфически связаны со способностью к азотфиксации; путь углерода в фотосинтезе и продукты фотосинтеза оказываются такими же, как у зеленых водорослей и у высших растений. Процессы фотосинтеза и азотфиксации могут быть независимыми, однако они протекают одновременно, в одной клетке, и это заставляет предполагать тесное переплетение этих двух процессов. Фогг отметил, что на свету азотфиксация идет интенсивнее. Оказалось, что водородные доноры, необходимые для восстановления молекулярного азота и образующиеся у многих организмов независимо от света, здесь связаны с фотохимическими реакциями. Такая фотохимическая редукция подтверждена для облигатного фототрофа Anabaena cylindrica; внутриклеточные восстановители, образующиеся при фотолизе воды, оказались вполне пригодными для восстановления азота. Правда, предполагается, что фотохимическая редукция азота при определенных условиях исключается, и тогда восстановление идет за счет водорода, освобождающегося в цикле Кребса.
Азотфиксация зависит от фотосинтеза и как от источника углеродных скелетов. К углеродным цепям, возникающим в фотосинтезе, присоединяется фиксированный азот. Было показано, что первым органическим соединением, содержащим N15, у Nostoc muscorum оказалась глютаминовая кислота, которая образуется при непосредственном участии продуктов фотосинтеза.
Наконец, энергия, необходимая для активации и восстановления молекулярного азота, может быть получена от переносчиков фотосинтетической энергии — АТФ. Об этом говорит необходимость АТФ для азотфиксации; АТФ может быть получена непосредственно путем фотосинтетического фосфорилирования.
Обнаружена локальная связь фотосинтеза и усвоения элементарного азота. Кокс с сотрудниками нашла наибольшую азотфиксирующую активность в той фракции бесклеточного экстракта Anabaena cylindrica, которая показала и максимальную фотосинтетическую активность. Эта фракция содержала главным образом фотосин- тетические ламеллы. Эксперименты с соответствующей фракцией из Chlorogloeopsis fritschii подтвердили, что здесь наблюдается также и максимальная интенсивность дыхания. Следовательно, в этих внутриклеточных структурах локализованы не только фотосинтетические пигменты, но и центры азотфиксации и дыхания. Такое предположение подтверждается открытием гидрогеназы в фотосинтетических ламеллах Anabaena cylindrica. Локализация трех функций в одних и тех же клеточных структурах делает понятной тесную метаболическую связь между этими процессами.
Показана коррелятивная зависимость между энергией азотусвоения и потреблением СО2. Выяснилось, что, с одной стороны, ассимиляция азота зависела от концентрации СО2 в газовой смеси, с другой стороны, скорость ассимиляции углерода удваивалась при увеличении содержания азота в смеси от 2 до 50%. Однако изменения температуры больше влияют на фиксацию азота, чем на фотосинтез. Предполагается, что некоторая часть процесса азотфиксации больше связана с дыханием, чем с фотосинтезом.
Обнаружено влияние ионизированного (облученного УФ-лучами) азота на активность азотфиксации у Anabaena cylindrica, A. uariabilis, Tolypothrix tenuis и Nostoc muscorum. У всех культур, получавших облученный азот, количество образованного сухого вещества было на 13—20% выше, чем в контроле, а количество фиксированного азота — в среднем на 28%. Предполагается, что ионы газообразного азота при облучении УФ-лучами оказываются более богатыми энергией и лете реагируют с ферментативной системой фиксации азота и что процессы фиксации азота требуют в этом случае меньшего расхода энергии. Возможно, что благодаря этому большая часть фотохимической энергии используется на синтез углеводов.
По современным представлениям об энзимных системах азотфиксации, в этом процессе действуют две системы ферментов: гидрогеназа, которая участвует в переносе электронов и водорода от доноров к акцептору и активирует водород, и нитрогеназа, катализирующая восстановление азота. У азотфиксирующих бактерий давно была установлена коррелятивная связь между гидрогеназной активностью и фиксацией азота. Однако до последнего времени гидрогеназа не была обнаружена у синезеленых водорослей. Только недавно она найдена у Anabaena cylindrica, и это привело к выводу, что у синезеленых, как и у бактерий, этот фермент освобождает активированный водород, направляя
его на другую энзимную систему — нитрогеназу. Переносчиками водорода, связывающими две ферментные системы, могут быть различные вещества, встреченные в бесклеточных препаратах бактерий и Cyanophyta, в особенности ферредоксин, обнаруженный у ряда бактерий, у Anabaena cylindrica и Nostoc muscorum. Для азотфиксации в бесклеточных препаратах оказался необходимым пируват. Na-пируват стимулировал азотфиксацию в клетках Anabaena cylindrica и рассматривается как источник восстановительной энергии.
В общей сложности в фиксации азота у Cyanophyta участвуют: 1) источники водорода и электронов, 2) гидрогеназа (если источником электронов служит ион Н+), 3) переносчик электронов (флавопротеин, ферропротеин или чаще всего ферредоксин), 4) нитрогеназа, 5) атмосферный азот, 6) источник энергии (фосфаты, богатые энергией, для активирования ннтрогеназы). Фиксированный азот затем переносится на углеродные цепи, одновременно продуцируемые в процессе фотосинтеза.
Путь азота в азотфиксации был исследован у Nostoc muscorum с применением N15. Наивысшая концентрация N15 была найдена в глютаминовой кислоте или во внутриклеточном аммонии, независимо от того, был ли источником меченого азота молекулярный или аммонийный азот.
Свободный аммоний, выделяемый из реакционной смеси, содержал 52 атом-% N15 (Schneider et al., 1960). Это говорит в пользу аммонийной гипотезы азотфиксации С. Н. Виноградского. NH3 рассматривается как наиболее вероятный первый продукт азотфиксации, который поступает в общий метаболизм через восстановительное аминирование а-кетоглутаровой кислоты, образующейся в цикле Кребса. Другим возможным путем считается образование цитруллина на ранних этапах фиксации азота.
Значительные количества фиксированного азота освобождаются в виде внеклеточных выделений. Это явление, многократно наблюдаемое у разных синезеленых, было подробно изучено у Anabaena cylindrica. Общее количество внеклеточных веществ в молодой культуре A. cylindrica достигает 50% фиксированного азота, но сильно изменяется в зависимости от условий культивирования и возраста культуры. Состав и количество внеклеточных выделений варьируют у испытанных видов. В молодой культуре A. cylindrica большая часть внеклеточных выделений находится в форме воднорастворимых полипептидов; позднее Фогг подчеркнул сложную и изменчивую природу этих веществ. Освобождение внеклеточных полипептидов не связано с автолизом и происходит неизменно в сочетании с ростом, в здоровой культуре. Внеклеточные выделения могут быть незначительными: например, в фильтрате Nostoc muscorum они составляли только 1% общего азота; по мнению Фогга, это происходит при достаточном количестве микроэлементов в среде. По данным Фуллера, в надосадочной жидкости после центрифугирования культур азотфиксирующих видов обнаружено небольшое количество нитратов, много аминного азота и совсем не было аммиака.
В старых культурах ввиду нестойкости полипептидов против гидролиза до 80% азота представлено аминокислотами. Правда, Ватанабе и в молодой культуре Calothrix brevissima нашел заметные количества аминокислот — аспарагиновой, глютаминовой и аланина — и не обнаружил полипептидов. В культуральных средах Nostoc sp. и Anabaena azollae тоже обнаружены аспарагиновая и глютаминовая кислоты и аланин. Культура Nostoc commune содержала в растворе около 30% фиксированного азота, в том числе 1/3 нитратов, 28% аммонийного и 20% аминного азота; отмечены две аминокислоты — глютаминовая и аспарагиновая, но здесь они не являются результатом гидролиза, так как белок содержит гораздо больше аминокислот.
Уиттон исследовал аминокислотный состав полипептидов в выделениях разных синезеленых, способных и не способных к азотфиксации. Обнаружено большое сходство состава аминокислот у всех видов, но особенно сходны по аминокислотному составу полипептиды, выделяемые азотфиксирующими водорослями Anabaena cylindrica и Nostoc sp. В значительных количествах найдены аланин, глицин и серии, кроме того, присутствовали аспарагиновая и глютаминовая кислоты, лейцин, треонин и валин. По составу аминокислот азотфиксирующие синезеленые не отличаются от других растений.
Пока неясно, могут ли сами водоросли повторно усваивать выделенные ими вещества. Азотистые соединения, выделяемые водорослями, могут разлагаться бактериями и прямо ассимилироваться Другими организмами; особенно они используются партнерами водорослей в лишайниковых и других симбиозах. Другая часть внеклеточных полипептидов способна формировать растворимые комплексы с элементами питания (например, с фосфором), с токсическими элементами (например, с медью) или с антибиотиками.