Действие фитогормонов в растении направлено в конечном счете на составляющие его клетки. При этом наблюдается, что клетки разных типов по-разному реагируют на один и тот же фитогормон.
Таким примером, в частности, является реакция клеток корня на обработку ауксином. В этом случае клетки меристемы перестают размножаться, клетки коровой паренхимы изодиаметрично растягиваются, что приводит к образованию утолщений на концах корней, клетки проводящего пучка переходят к делению, образуют камбий и вторичную ксилему и флоэму, некоторые клетки перицикла также переходят к активному делению и образуют боковые корни. Подобное же различное поведение клеток в ответ на обработку ИУК мы наблюдали у междоузлий зеленых проростков гороха. Проростки в возрасте 7—8 дней опрыскивали раствором ИУК в концентрации 100 мг/л и через сутки изготовляли срезы из середины третьего междоузлия на замораживающем микротоме, окрашивали таннином с железоаммонийными квасцами, заключали в глицерин и фотографировали. Увеличение толщины достигалось за счет увеличения размеров клеток коровой паренхимы. Кроме того, видно увеличение объема проводящей ткани, которое происходило за счет активации камбия и увеличения количества клеток. Таким образом, и в этом случае характер реакции на ИУК зависел от типа клеток.
Другим примером может служить реакция клеток верхушки стебля на обработку гиббереллином. В большинстве случаев под влиянием этой обработки увеличивается длина междоузлий, а количество их не меняется. Микроскопические исследования верхушечной меристемы показали, что в таких случаях гиббереллин усиливал митотическую активность в корпусе и субапикальной меристеме, но не изменял ее в тунике, хотя клетки этих зон меристемы мало отличались по внешнему виду. На цитокинины также может наблюдаться неодинаковая реакция клеток. В качестве примера можно привести данные о том, что у одних видов растений (табак, ячмень) старение клеток листьев задерживается кинетином, тогда как у других (одуванчик, настурция, щавель) гиббереллином, а кинетин не действует.
Эту способность клеток реагировать на фитогормон определенным образом можно по аналогии с тем, как это принято в эмбриологии животных, назвать компетентностью. Рассматривая приведенные выше примеры различной компетентности клеток, можно сказать, что характер реакции на фитогормон определяется не только типом фитогормона и его Концентрацией, но и компетентностью клеток. Поэтому для того чтобы оценить роль фитогормонов в морфогенезе, следует выяснить, чем определяется компетентность клеток.
В самом общем смысле компетентность клеток определяется всей их предыдущей историей, начиная от первых делений зиготы. Но такое общее объяснение мало что дает для постановки конкретных опытов и для выяснения характера действия фитогормонов на клетку. Интересной гипотезой, выдвинутой для объяснения разной компетентности клеток по отношению к одному и тому же воздействию, является гипотеза «потенциально активных генов», предложенная Мором. Мор наблюдал, что облучение дальним красным светом вызывало появление антоциана лишь в некоторых органах проростка горчицы. Он предположил, что гены, ответственные за синтез антоцианов, находятся в этих органах в потенциально активном состоянии, из которого они могут быть переведены в активное облучением дальним красным светом. В других органах, не образующих антоциан, эти гены находятся в неактивном состоянии и не могут перейти в активное под влиянием дальнего красного света. Таким образом, согласно этой гипотезе, следует считать, что клетки, обладающие разной компетенцией, имеют разный набор потенциально активных генов. Однако эта гипотеза не решает поставленного вопроса о возникновении компетентности клеток, а лишь переводит его на другой уровень, на уровень генов. Кроме того, если принять эту гипотезу, то возникает вопрос о том, в чем состоит различие между неактивными и потенциально активными генами, на который пока нет ответа.
В некоторых случаях характер реакции клеток на фитогормон может зависеть от концентрации другого фитогормона, от их взаимного соотношения. Наиболее ярким примером в этом отношении может служить роль ауксина и кинетина при действии на сердцевинную паренхиму стебля табака. Если кусочки сердцевинной паренхимы высаживали на среду, содержащую только ИУК, то клетки увеличивались в размерах, но не делились. Если же в среде был кинетин, то в клетках увеличивалось содержание белка и нуклеиновых кислот, но деление также не происходило. Лишь при совместном действии ауксина и кинетина клетки сердцевинной паренхимы могли осуществлять размножение и образовывать каллус. Образовавшийся каллус в зависимости от соотношения ИУК и кинетина находился либо в состоянии недифференцированного роста, либо переходил к органогенезу (образование листовых почек, корней). Таким образом, способность клеток реагировать на фитогормон, например, на ИУК, зависит от присутствия или от концентрации другого фитогормона — цитокинина.
В наших опытах было показано, что гиббереллин при обработке зеленых проростков низкорослого гороха стимулировал размножение и растяжение клеток, а при обработке этиолированных растений стимулировал только растяжение клеток. По данным других авторов, гиббереллин вызывал стимуляцию роста только зеленых проростков и не действовал на этиолированные. В этих случаях компетентность клеток определяется внешними факторами, в данном случае светом. Но если учесть, что, согласно некоторым данным, на свету образуются ингибиторы роста, действующие как антигиббереллины, то можно считать, что и в этом случае компетентность клеток к гиббереллину зависит от присутствия других веществ, в данном случае ингибиторов.
В некоторых случаях способность клеток реагировать на фитогормон может определяться активностью ферментов, разрушающих его. В этом отношении показательны данные относительно роли ИУК-оксидазы и ее ингибитора в способности разных междоузлий реагировать на эндогенный и экзогенный ауксин. Было показано, что молодые междоузлия растений разрушают ауксин очень слабо или вообще не разрушают его и обладают высокой скоростью роста. С возрастом скорость роста междоузлий уменьшается, а способность разрушать ауксин возрастает; закончившие рост междоузлия разрушают его с наивысшей скоростью. При этом разная способность к разрушению определялась не столько количеством фермента, сколько содержанием ингибитора фермента.
Брэнде и Кенде наблюдали, что бензиладенин-С14 накапливался лишь в тех нитях каулонемы мха, которые реагировали на него образованием почек. Они предположили, что это различие связано с наличием рецепторов цитокинина в одних клетках и его отсутствием в других. Таким образом, наличие или отсутствие рецепторов фитогормона также может быть одним из механизмов определения компетентности клеток.
Мы привели только некоторые, наиболее простые механизмы определения компетентности клеток к фитогормонам. Большое число других случаев компетентности нельзя объяснить на основании известных в настоящее время механизмов. Это, к примеру, упоминавшийся выше случай разной реакции поверхностных слоев и внутренней части стеблевой меристемы на гиббереллин или характер действия ауксина на образование боковых корней. Известно, что боковые корни образуются из клеток перицикла, расположенных напротив лучей первичной ксилемы. Поэтому боковые корни закладываются рядами, число которых равно числу лучей первичной ксилемы. При усилении корнеобразования с помощью ауксина новообразование корней идет также по этим рядам, но не между ними. Поэтому можно предполагать, что способность клеток перицикла активироваться, перейти к делению и дать начало корневым зачаткам определяется не только ауксином, но и каким-то влиянием, исходящим от первичной ксилемы, причем это влияние сказывается лишь на очень близком расстоянии.
Клетки, способные реагировать на фитогормон, можно по аналогии с тем, как это принято в отношении гормонов животных, называть клетками-мишенями данного фитогормона. Наиболее важным в настоящее время является, как нам кажется, выяснение вопроса о том, каков механизм действия фитогормонов на клетки-мишени. В этом отношении, по-видимому, еще предстоит много работы в феноменологическом направлении, в направлении четкого показа роли фитогормонов в тех или иных морфогенетических реакциях клеток. Но в тех случаях, когда роль фитогормона уже показана, можно переходить к углубленному анализу механизма реакции клеток.
Способы изучения роли и действия фитогормонов можно условно разделить на:
1) топографический, когда прослеживается, как совпадают участки тела растения, осуществляющие тот или иной тип морфогенетических реакций клеток, с наличием и концентрацией в этих участках разных фитогормонов;
2) хронологический, когда прослеживается совпадение реакции клеток и концентраций фитогормонов во времени;
3) экспериментальный, когда тот или иной тип реакции клеток пытаются вызвать, давая фитогормон извне.
Конечно, для того чтобы получить полное представление о характере действия фитогормона, необходимо сочетание всех трех методов. Однако первый и второй способы имеют гораздо большее значение при выяснении роли фитогормонов в целом растении, тогда как при изучении характера действия фитогормона на клетки-мишени особое значение приобретает экспериментальный метод.
Следует отметить, что при обработке целого растения фитогормонами часто нельзя быть уверенным в том, что наблюдаемая реакция органов растения и клеток, составляющих эти органы, обусловлена непосредственно примененным фитогормоном.
В этом смысле особенно характерны результаты опытов по применению гиббереллина, Так, угнетение роста корней под влиянием обработки гиббереллином, по-видимому, вызывается не непосредственно гиббереллином, а является следствием ускорения роста стебля, конкурирующего с корневой системой за необходимые для роста метаболиты, как показано в работах многих авторов, в том числе и в опытах с отрезками проростков кукурузы. Отрезки, имеющие длину мезокотильной части 5 мм и колеоптильной части 10 мм, инкубировали 2 часа в растворах гиббереллина или ИУК и высаживали вертикально в 1%-ный агар с цитратнофосфатным буфером pH 5,5. Через 48 часов подсчитывали количество корней и измеряли длину листа и корней. Усиление роста листа под влиянием гиббереллина сопровождалось уменьшением корнеобразования и роста корней, а усиление корнеобразования под влиянием ИУК — угнетением роста листа. Кроме того, есть основания полагать, что и ускорение роста стебля под влиянием гиббереллина не является непосредственной реакцией на него. По данным Чайлахяна и Ложниковой, основная масса эндогенных гиббереллинов содержится в средних листьях, а не в стеблях. В наших опытах проростки гороха обрабатывали путем нанесения капли раствора гиббереллина (100 мг/л) на верхушку, через 5 дней разделяли на листья и стебли, ткань замораживали сухим льдом и лиофилизировали. Навески по 3 г лиофилизированного материала экстрагировали метанолом. Экстракт упаривали, очищали от пигментов и извлекали кислую фракцию этилацетатом. Хроматографировали в смеси изопропил— аммиак — вода (10:1:1). Хроматограммы разрезали на 10 зон, биологическую активность каждой зоны испытывали по влиянию на рост отрезков колеоптилей пшеницы (биопроба на ауксин) и отрезков проростков кукурузы в зоне первого узла (биопроба на гиббереллин). Почти весь введенный при обработке гиббереллин обнаруживался в листьях, а увеличение ауксиновой активности — в стеблях.
Можно предположить, что реакция стебля на гиббереллин вызвана не самим гиббереллином, а усилением образования ауксина в листьях и его передвижения в стебель.
Еще одним примером может служить ускорение роста проростков под влиянием гиббереллина при обработке семян. В этом случае всегда имеется неясность, связано ли действие гиббереллина с усилением гидролиза запасных питательных веществ в эндосперме или в семядолях, или с действием гиббереллина непосредственно на зародыш. Так, например, в опытах с изолированными зародышами пшеницы было показано, что рост колеоптиля и настоящих листьев усиливался ГК, а рост корешков не изменялся. Если же гиббереллином обрабатывали целые семена, то тогда рост корешков также усиливался. Это дало основание авторам предположить, что действие ГК на рост корешков является косвенным, связанным с активацией процессов гидролиза запасных веществ эндосперма.
Приведенные примеры показывают, какие трудности возникают при использовании целых растений для изучения характера действия фитогормона на клетки-мишени. Эти затруднения вызваны различными корреляционными связями между клетками и органами в целом организме и тем, что одни гормоны могут вызывать синтез других, уже непосредственно действующих на клетки фитогормонов. Поэтому оптимальным условием для изучения роли фитогормонов в реакции клеток-мишеней является использование изолированной части растения, которая непосредственно реагирует на фитогормон, конечно, при условии, что реакция на фитогормон сохраняется при изолировании. Это объясняет широкое использование в опытах по изучению фитогормонов изолированных частей растений и культуры изолированных тканей и клеток.
Исследование действия фитогормона на клетки-мишени должно включать в себя изучение локализации фитогормона в клетке, механизма первичной молекулярной реакции и уровня, на котором осуществляется регулирующее действие фитогормона (т. е. способа реализации первичной реакции).
Локализация ауксина в клетках изучалась методами циторадиоавтографии и дифференциального центрифугирования. В этих опытах не было обнаружено какой-то особой локализации. Меченый ауксин распределялся равномерно по всей цитоплазме или обнаруживал скопление в области ядра, где у вакуолизированных клеток скапливается и цитоплазма. При дифференциальном центрифугировании основная масса ауксина (экзогенного и эндогенного) обнаруживалась в растворимой части цитоплазмы. Следует отметить, что по последним данным активная форма ауксина при действии на растяжение клеток является легкообмениваемой, транспортной, и поэтому она теряется при изготовлении препаратов для циторадиоавтографии, а при фракционировании клеток на составляющие их органоиды может перераспределяться между ними. Кроме того, даже при использовании лиофилизированных срезов активный ауксин составляет лишь наименьшую часть всего поглощенного клеткой ауксина и не всегда может быть обнаружен. Поэтому задача изучения внутриклеточной локализации ауксина не является простой. Однако работы подобного рода чрезвычайно важны для понимания характера действия ауксина клетки.
Это справедливо также и в отношении других фитогормонов. Циторадиоавтографическое определение внутриклеточной локализации введенного кинетина после обычной техники изготовления парафинированных срезов показало, что он распределялся над ядром и цитоплазмой и не обнаруживался над ядрышком. В этих работах также отсутствовали доказательства того, что обнаруженный в клетках цитокинин является гормонально активным.
Постановка вопроса о первичной молекулярной реакции клеток на фитогормоны возникает в связи с высокой стереоспецифичностью их действия. В молекулах ауксинов, гиббереллинов, цитокининов имеются атомы и группировки, которые очень важны для их биологической активности, тогда как другие менее важны или вообще не связаны с ней. Например, индолилкарбоновая кислота отличается от ИУК лишь отсутствием группы — СН2 — в боковом радикале, но не обладает ауксинной активностью, тогда как замена атома азота в пятичленном цикле индольного кольца на группу —СН = СН— (нафтилуксусная кислота) мало сказывается на активности. Нафтилуксусная кислота в свою очередь активна как ауксин только тогда, когда ацетил присоединен в первом положении нафтильного кольца, а не во втором. Из двух оптических изомеров абсцизиновой кислоты активен лишь один, найденный в растениях. Примеры подобного рода можно привести также и для цитокининов.
Исследование различных производных фитогормонов позволяет сформулировать общие принципы строения, которым должны удовлетворять их молекулы, чтобы иметь гормональную активность. Так, для ауксинов такими общими принципами являются наличие ароматического кольца и карбоксильной группы, входящей в состав ацетила, или наличие других боковых цепей с четным числом углеродных атомов, создание определенной электронной структуры в ароматическом ядре с помощью различных замещений. Все это позволило авторам предположить, что в клетках, способных реагировать на фитогормон, имеется соответствующий рецептор, при соединении с которым образуется активный комплекс. Для того чтобы вступить в связь с рецептором, фитогормон должен иметь определенную структуру, возможно, являющуюся комплементарной к воспринимающему центру рецептора. При изменении структуры фитогормона образовавшаяся молекула либо не может образовать связь с рецептором, либо возникший комплекс не обладает активностью.
На основании этих предположений и экспериментальных данных по действию на рост отрезков колеоптилей различных галогензамещенных производных феноксиуксусной кислоты, в том числе 2,4-Д, и по их взаимодействию с 2,4-дихлоранизолом, представляющим собой продукт декарбоксилирования 2,4-Д, была сформулирована гипотеза двухкомпонентного действия ауксина. Согласно этой гипотезе, ауксин соединяется с рецептором в активный комплекс двумя точками своей молекулы: карбоксилом и каким-то участком несимметричного ароматического кольца (в случае производных феноксиуксусной кислоты это шестой углеродный атом). Поэтому такие производные, как 2,4,6-трихлорфеноксиуксусная кислота и 2,4-дихлоранизол, действовали как конкурентные антиауксины, поскольку они могли связываться с рецептором ауксина лишь в одной точке и препятствовали образованию активного комплекса. Эти авторы предполагали, что ауксин соединяется в активный комплекс с рецептором ковалентно.
Разные авторы предполагали, что внутриклеточным рецептором ауксина могли быть белки и более конкретно кислая фосфатаза, коэнзим A, нуклеиновые кислоты. Однако данные в поддержку этих предположений были недостаточными, они не подтверждались на других объектах и в других лабораториях, да и в работах самих авторов эти гипотезы не получили дальнейшего развития.
С другой стороны, накапливались данные о том, что в активности ауксинов большую роль играет сочетание липофильных и гидрофильных свойств. На основании этого некоторые исследователи предполагали, что действие ауксина локализовано в цитоплазматических мембранах. Но следует учесть, что повышение активности ауксина при увеличении его липофильности может быть связано с увеличением способности более липофильного соединения проникать в клетки.
В работах последнего времени появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что ауксин, передвигающийся в системе полярного транспорта, активен в стимуляции растяжения клеток. Было установлено, что во многих случаях различия в скорости роста растений не удается связать с различиями в содержании экстрагируемого ауксина, тогда как такая корреляция наблюдалась почти всегда, если определялся диффундирующий в агар ауксин. В работе Винтера и Тимана было показано, что поступающий в клетки отрезка колеоптиля ауксин частично включается в транспортную систему, передвигается базипетально и выделяется в агаровый блок-рецептор.
Другая часть поступившего ауксина не выделяется в блок-рецептор, а связывается тканью. Эту часть авторы назвали «иммобильным» ауксином, но его можно выделить из ткани с помощью эфирной экстракции. При этом в эфир переходит ИУК в неизмененном виде. Стимулирование роста отрезка наблюдалось до тех пор, пока происходило полярное передвижение ауксина, и прекращалось, когда весь способный к транспорту ауксин переходил в блок-рецептор. При этом в ткани еще оставалось значительное количество «иммобильной» ИУК, которая, по данным авторов, связана непрочной связью с белками и освобождается при нарушении структуры белков с помощью протеолитических ферментов или мочевины.
Таким образом, полученные данные позволили предположить, что стимуляцию растяжения клеток вызывает полярно передвигающийся ауксин. Это положение было подтверждено в опытах по выяснению роли ауксина в фототропической и геотропической реакциях с помощью радиоактивной ИУК. Вначале эти опыты были предприняты с целью проверки теории Холодного — Вента о том, что гео- и фототропические изгибы обусловлены латеральным смещением ауксина и более быстрым ростом той стороны, на которую происходит смещение. Первоначальные опыты с ИУК-С14 не подтвердили этой теории, так как количество радиоактивного материала, экстрагируемого из освещенной и теневой половинок, или из верхней и нижней половинок, при геоиндукции не отличалось. Однако, когда определяли радиоактивность диффундирующего в агар из верхушек ауксина, то была обнаружена очень четкая разница. Наиболее интересны в этом отношении опыты Шен-Миллера и Гордона.
Эти авторы определяли ИУК-С14 не только в агаровых кубиках, контактирующих с освещенной и теневой половинками верхушек колеоптилей кукурузы, но и в самих половинках верхушки. Было показано, что суммы ИУК в ткани и в агаровом кубике равны на освещенной и теневой стороне, но из теневой половинки в агар переходило больше ауксина. Таким образом, более активный рост наблюдался там, где было больше транспортируемого ауксина. По предположению авторов, свет или гравитация изменяют способность разных сторон стимулируемого органа к полярному транспорту ауксина, что уже в свою очередь приводит к возникновению разности в скорости роста сторон.
Это положение подтверждается тем, что вещества, нарушающие транспорт ауксина (2,3,5-трийодбензойная кислота, нафтилфталаминовая кислота, 2,3,6-трихлорбензойная и 2,6-дихлорбензойная кислоты, морфактин), уменьшали или полностью подавляли гео- и фототропическую реакцию.
Транспорт ауксина слагается из двух компонентов: скорости перемещения, определяемой как расстояние, пройденное молекулой ауксина за единицу времени, и интенсивности транспорта (плотности потока), определяемой как количество молекул, одновременно проходящих через условную площадь поперечного сечения органа. Очевидно, плотность потока зависит от количества рецепторов-переносчиков в ткани (или, точнее, от их концентрации). В работах Накви и Гордона было показано, что различия в способности к транспорту ауксина, возникающие под влиянием света или гравитации, обусловлены изменениями интенсивности транспорта, а не скорости перемещения ауксина.
Таким образом, вопрос об активной форме ауксина при стимуляции роста растяжением тесно смыкается с вопросом о том, что такое транспортная форма ауксина и какова природа его рецепторов-переносчиков. В этой связи интересны наблюдения о ходе поглощения ауксина из растворов. Было показано, что поглощение ауксина можно разделить на две фазы: быстрая первоначальная адсорбция, длящаяся около 15—30 минут, и последующее, более медленное метаболитическое накопление, происходящее на протяжении всего остального периода инкубации. Пул и Тиманн показали при этом, что если отрезки колеоптилей, находившиеся в растворе ИУК-С14, через разные промежутки времени переносили в среду без ИУК или с нерадиоактивной ИУК, то при этом часть радиоактивности выделялась в среду. Выделяемая радиоактивность не зависела от количества поглощенной ИУК, т. е. от времени инкубации в растворе ИУК-С14, и равнялась количеству, поглощенному за счет первоначальной адсорбции.
Эта работа позволила предположить, что ауксин, поступающий в отрезки колеоптилей, находится вначале в легкообмениваемой с наружной средой форме, из которой часть его постепенно метаболически связывается, т. е. переходит в необмениваемую с наружной ИУК форму, а убыль пополняется за счет адсорбции ауксина из раствора. Для каждой концентрации ауксина устанавливается свое динамическое равновесие между скоростью адсорбции ауксина и скоростью метаболитического связывания, соотношение между ними определяет количество ауксина в легкообмениваемой форме.
Чтобы решить вопрос о том, с какой формой ауксина связана вызванная им стимуляция роста, необходимо установить, сохраняется ли эта стимуляция после того, как отрезки перемещены из раствора ауксина в раствор без ауксина. С этой целью мы провели опыты, которые показали, что стимуляция скорости роста после такого перемещения очень быстро исчезает. Опыты ставились следующим образом: отрезки колеоптилей кукурузы инкубировали в растворе метилового эфира ИУК (5 мг/г) 3 часа, а затем часть из них 3 раза промывали на воронке Бюхнера водой и переносили в среду без ауксина. Для измерения роста отрезки обсушивали фильтровальной бумагой и взвешивали на торзионных весах.
На этом же объекте (отрезки колеоптилей кукурузы) были поставлены опыты по динамике поглощения и выделения ИУК-С14, которые подтвердили данные Пула и Тиманна о двух фазах поглощения ауксина из раствора.
Для определения выхода ИУК-С14 отрезки инкубировали в растворе ИУК-С14 (5 мг/л) 3 и 6 часов, затем отрезки быстро споласкивали водой и переносили в чашку Петри со средой без ауксина. Через 15, 30, 60, 120 и 180 минут отрезки вновь переносили в чашки со свежей средой, а среду, в которой находились отрезки, подкисляли до pH 3,0 серной кислотой и экстрагировали эфиром. После упаривания эфира экстракт переносили в чашечки для подсчета радиоактивности, которую определяли на торцовом счетчике. Для того чтобы сопоставить количество радиоактивности, выделенной в среду, с убылью радиоактивности в отрезках, часть отрезков растирали с небольшим количеством спирта и переносили в чашечки для подсчета радиоактивности сразу после 3- или 6-часовой инкубации в растворе ИУК-С14 и через 3 часа пребывания в чашках Петри со средой без ИУК. Разность между количеством радиоактивности, обнаруженной в отрезках колеоптилей кукурузы сразу после инкубации в растворах ИУК-С14, и оставшимся после 3 часов инкубации на среде без ИУК-С14 позволяла судить об общей убыли радиоактивности из отрезков.
Убыль радиоактивности из отрезков за 3 часа составляла около 25% от поглощенной и была в отличие от данных, полученных Пулом и Тиманном, пропорциональна количеству поглощенной ИУК. Суммарное количество радиоактивности, обнаруженное в среде, меньше, чем убыль радиоактивности в отрезках, и было приблизительно одинаковым при 3- и 6-часовой предварительной инкубации отрезков в растворе ИУК-С14. С помощью авторадиографии было показано, что в эфирном экстракте из среды, в которой инкубировались отрезки, содержится только ИУК-С14. Несовпадение количества радиоактивности, обнаруженной в среде, и убыли ее в отрезках, вероятно, можно объяснить тем, что часть выделяемого из отрезков радиоактивного материала не удается извлечь из среды эфиром, либо тем, что часть поглощенной радиоактивности теряется за счет декарбоксилирования ИУК-С14 и выделения С14O2. Это выделение в наших опытах было обнаружено.
Основная часть поглощенного ауксина выделяется в течение первых 30—60 минут. При этом ход выделения приблизительно одинаков у отрезков, поглощавших ИУК-С14 3 и 6 часов.
Изложенные данные позволяют сделать вывод, что при перенесении отрезков из среды с ИУК в среду без ИУК происходит выделение легкообмениваемой части поглощенной ИУК и прекращается стимуляция роста, вызванная ИУК. Оба эти процесса происходят в одно и то же время. Поэтому можно предположить, что именно ИУК, находящаяся в легкообмениваемой форме, является активной в стимуляции растяжения клеток отрезков колеоптилей. Целый ряд изменений, возникающих в отрезках колеоптилей под влиянием обработки их ауксином, устанавливается на новом уровне уже через 15—20 минут, т. е. тогда, когда произошло первичное адсорбционное поглощение, но еще не накопилось обнаруживаемых количеств метаболитически связанной ИУК. Так, в наших опытах с отрезками колеоптилей кукурузы определяли влияние метилового эфира ИУК на скорость поглощения кислорода. Для этого отрезки длиной 10 мм помещали в сосудики аппарата Варбурга и определяли поглощение O2 в течение часа. Затем поворотом боковой реторточки вводили в инкубационную среду раствор Me-ИУК, а в контроле — среду без ауксина и определяли скорость дыхания за каждые 15 минут в течение 24 часов. Уже через 15 минут скорость дыхания в отрезках, обработанных Me-ИУК, была выше на 40%, чем в контроле. Эта стимуляция сохранялась в течение последующих 24 часов.
Подобное влияние ауксина на дыхание наблюдалось в опытах итальянских исследователей. В этот же период времени происходило уменьшение вязкости цитоплазмы, сохранявшееся при дальнейшей инкубации, изменялось распределение в сахарозном градиенте компонентов клеточных стенок и их пластичности. Все это позволяет предположить, что именно первично адсорбированный ауксин является активным в стимуляции роста.
Вероятно, ауксин в транспортной и ауксин в легкообмениваемой форме — это одно и то же, так как транспортируемый полярно ауксин некоторые авторы собирали путем диффузии его в воду, а не в агар. Кроме того, время прохождения ИУК через отрезок колеоптиля длиной 10 мм, (при скорости транспорта 12—15 мм в час) и время выделения ИУК из отрезков в среде без ИУК совпадают между собой. Следует отметить, что «иммобильная» ИУК не выделялась в воду даже при диализе гомогенатов из отрезков колеоптилей. Можно предполагать поэтому, что вопрос о природе рецепторов-переносчиков ауксина при полярном транспорте и о природе структур, адсорбирующих непрочно ауксин из раствора, — это один и тот же вопрос.
Наиболее вероятным местом адсорбции, действия на рост и транспорта ауксина в настоящее время считаются цитоплазматические мембраны. При полярном транспорте α-нафтилуксусной кислоты-O18 (НУК) не было обнаружено разбавления О18 в молекуле НУК изотопом О16. Следовательно, во время транспорта не происходит образования эфирной, ковалентной связи между молекулами ауксинов и переносчиков. Но известно, что из лиофилизированных тканей ауксин не удается экстрагировать безводным эфиром или абсолютным спиртом. Это позволяет предположить, что какие-то связи между ауксином и переносчиком существуют. Правда, при этом есть возможность того, что эти связи образуются во время лиофилизации.
В связи со всем вышесказанным можно поставить вопрос, обладают ли цитоплазматические мембраны достаточной степенью избирательности, чтобы объяснить высокую степень зависимости биологической активности ауксинов от их химического строения. Д. А. Сабинин, обсуждая вопрос о клеточных мембранах, говорит о том, что липоидные монослои, состоящие из нескольких различных веществ, имеют довольно сложную упорядоченную структуру, которая может коренным образом перестраиваться при введении в монослой других липоидных веществ. Он приводит данные, показывающие, что монослои лецитина по-разному изменяют свои свойства в зависимости от того, действуют ли на них билирубином или биливердином, хотя различие в строении между этими двумя веществами незначительно. Можно предполагать, что и различие в строении α-НУК и β-НУК, ИУК и индолилкарбоновой кислоты и других будет улавливаться цитоплазматическими мембранами, которые должны обладать гораздо большей избирательностью и способностью к изменению своих свойств под влиянием различных веществ, чем простые монослои липидов.
Изучение вопроса об активной форме других фитогормонов, гиббереллинов и цитокининов, еще только начинается, так как сами эти вещества открыты еще сравнительно недавно. Однако можно отметить некоторые свойства, отличающие их активную форму от активной формы ауксина. Одним из таких отличий является их способность действовать длительное время на ткани после однократной обработки.
В опытах Накамуры с сотр. было показано, что достаточно подержать отрезки верхушек этиолированных проростков гороха в растворе ГК 2 часа, чтобы получить такой же ростовой эффект, как и от постоянного 48-часового пребывания их в этом растворе. По данным Кауфмана 5-минутная инкубация отрезков междоузлия овса в растворе ГК вызывала такую же реакцию, как и 48-часовая.
Наши опыты с отрезками этиолированных проростков кукурузы в зоне первого узла (реагирующей частью является влагалище первого настоящего листа) показали, что и у этого объекта отрезки можно было «заряжать» предварительно гиббереллином при кратковременной инкубации, чтобы получить за 48 часов полную величину реакции на гиббереллин. Отрезки инкубировали в растворах гиббереллина 1,10 и 100 мг/л в течение разных промежутков времени, затем их промывали водой и переносили в среду без гиббереллина. Через 48 часов измеряли длину влагалища первого листа и высчитывали величину ростовой реакции, которую выражали в процентах превышения над приростом в контроле. При этом оказалось, что продолжительность предварительной инкубации, необходимой для получения одной и той же величины ростовой реакции на гиббереллины, зависит от концентрации. Так, при концентрации 1 мг1л необходимо было инкубировать отрезки в растворе гиббереллина около 10 часов, чтобы получить за 48 часов роста половину максимальной величины ростовой реакции; при концентрации 10 мг/л для этого было достаточно приблизительно около 70 минут предварительной инкубации, а при концентрации 100 мг/л было достаточно всего 5 минут. Можно предполагать, что время предварительной инкубации (t) и концентрация гиббереллина (С) связаны между собой соотношением С ∙ t = const.
Скорость связывания гиббереллина, о которой судили по величине ростовой реакции отрезков через 48 часов после переноса на среду без гиббереллина, зависит от температуры во время инкубации в растворе ГК. В этих опытах отрезки погружали на некоторое время в растворы гиббереллина при температурах 15 и 25°, затем их споласкивали водой, переносили в среду без гиббереллина и инкубировали 48 часов при температуре 25°. Таким образом, поглощение гиббереллина происходило при разных температурах, а осуществление ростовой реакции на гиббереллин — при одной и той же температуре. Поэтому величина ростовой реакции могла служить мерой количества поглощенного гиббереллина. Рассчитанный на основании полученных данных температурный коэффициент Q10 поглощения гиббереллина составлял более 2,0 в интервале 15—25°. Все это позволяет предполагать, что гиббереллин во время образования активного комплекса связывается с каким-то рецептором химически, т. е. ковалентной связью.
В настоящее время неизвестно, с чем именно связывается гиббереллин в клетке. При дифференциальном центрифугировании гомогената гипокотилей фасоли ГК оставалась в надосадочной жидкости при 104 000 g, но находилась в осадке при 170 000 g. Если не учитывать возможные артефакты, то можно предполагать, что ГК связана с мембранами эндоплазматического ретикулума. Однако опыты с гиббереллином А1 меченным тритием, показали, что гиббереллин в растении вступает в связь при образовании активной формы, по всей вероятности, нековалентно.
Относительно кинетина известно, что он при нанесении на стареющий лист локализуется и действует лишь в месте нанесения. Действие однократной обработки кинетином сохраняется в течение нескольких дней. Это дает некоторые основания для предположения о том, что цитокинины связываются в активный комплекс ковалентно. Однако в опытах по использованию бензиладенина (БА) для индукции образования почек на каулонеме мха фунарии было показано, что действие БА исчезает при переносе каулонемы в среду без БА в течение первых 72 часов. При этом БА-С14 удаляется из ткани. В этом случае, очевидно, связь цитокинина в активном комплексе — непрочная, и, вероятно, нековалентная. В растворимой РНК, выделенной из растений, дрожжей и животных, найдены минорные основания, обладающие цитокининовой активностью в биопробах и имеющие химическое строение, сходное с известными цитокининами. Некоторые авторы склонны объяснять гормональную активность цитокининов именно этим. Однако это предположение нуждается в подтверждении, так как может оказаться, что включение цитокининов в транспортную РНК — это эффект, сопутствующий гормональному действию, но не основной.
В этой связи необходимо обратить внимание на то, что цитокинины встречаются, в составе транспортной РНК у организмов (дрожжи, животные), для которых цитокинины не являются гормонами. Кроме того, до сих пор не было обнаружено включения введенного извне цитокинина в т-РНК в растениях.
По данным Кенде и Таварес, синтетический цитокинин 6-бензиламино-9-метилпурин обладал таким же биологическим действием, как и бензиладенин, но не включался в т-РНК из-за метилирования. Активность цитокининов, входящих в состав т-РНК почек сосны, составляла лишь 1 % от общей активности всех цитокининов ткани. Все это говорит о маловероятности такого гормонального действия цитокинина.