Работа Крика и его сотрудников существенно отличалась от исследований многих биологов, которые ставили самые разнообразные опыты без единого плана, уповая на «авось».
В опытах Крика, напротив, гипотеза предшествовала эксперименту. Ни одного лишнего опыта, ни одного ненужного шага — это требование выполнялось с самого начала.
Тот же метод исследований лежал в основе опытов Ф. Жакоба и Ж. Моно, связанных с проникновением в тайны наследственности, проведенных во Франции, в институте Пастера. Благодаря работе этих ученых удалось разрешить старую загадку, мучившую биологов не один десяток лет.
Два примера из области биохимической генетики помогут нам понять суть этой загадки. Общеизвестно, что в крови находится гемоглобин, который синтезируется в кроветворной системе. При этом, как точно выяснили ученые, синтез гемоглобина управляется специфическими генами в хромосомах. Все это понятно, но… есть небольшое «но»: гены, ответственные за синтез гемоглобина, имеются не только в клетках кроветворных органов, но и во всех клетках тела организма. Однако по непонятным причинам они не работают, предоставляй право трудиться своим собратьям в кроветворной системе.
Забавно, не правда ли? Мы уже привыкли к тому, что если наследственность налицо, то и деваться некуда, ген сработает. Однако при ближайшем рассмотрении оказывается, что есть какие-то непонятные системы, заставляющие работать одни гены и подавляющие активность других. Но так ли уж непонятны эти системы? И тут мы можем познакомиться со вторым примером, но уже из области «биохимии микроорганизмов.
Почти 60 лет назад было описано явление так называемой «ферментативной индукции». Исследовался обмен веществ микробных клеток. При этом обнаруживали, что в клетке не синтезируются некоторые ферменты, скажем, ферменты, сбраживающие лактозу, если такая бактерия культивировалась на питательной среде без лактозы. После этого к среде, где выращивались эти бактерии, добавляли некоторое соединение, называемое индуктором, например галактозид, и тотчас же в клетке начинали интенсивно синтезироваться ферменты, участвовавшие в сбраживании лактозы: β-галактозидаза и пермеаза. Стоило убрать галактозид, и сразу же синтез ферментов прекращался.
Шли годы, ученые узнали, что синтез этих двух ферментов закодирован в наследственном аппарате, но загадка индукции оставалась нерешенной. Исследовали другие биохимические реакции, и оказалось, что подобных систем очень много. Стало ясно: что-то в клетке в зависимости от условий существования или, как говорят, в зависимости от внешней среды, влияет на жизнедеятельность бактерии. Но где осуществляется в клетке эта регуляция — на уровне ДНК, РНК или белка — было неясно.
Вы уже познакомились с тем, как передается наследственная информация от ДНК к белку. На любом из этапов этой передачи — и на самой ДНК, и на информационной РНК, и на растворимой РНК и, наконец, в рибосомах — может произойти блокирование и разблокирование информации, и тогда либо начнется, либо будет подавлен синтез ферментов. Проникновение в тайны механизмов подобного блокирования могло прояснить эту загадочную индукцию и ответить на вопрос, почему одни клетки синтезируют гемоглобин, а другие нет.
На эти-то вопросы и ответили французские ученые. Они доказали, что ДНК сама управляет собой, что в ней, помимо генов, дающих информацию для синтеза ферментов (их назвали структурными генами), есть гены, управляющие этими структурными генами. Конечно, можно было бы просто привести окончательные результаты их исследований, но вряд ли это удовлетворит любознательного читателя. Ведь важно знать не только, что сделано, но и как сделано. Читая о том, как совершилось то или иное открытие, мы можем еще раз пройти по «неизведанным тропам», испытать еще раз чувства, которые волновали самих первопроходцев — ученых, сделавших открытие, а это и составляет эмоциональную силу открытий. И, наконец, знакомство с историей открытий всегда учит нас, обогащает новыми знаниями, новыми приемами исследований.
Так давайте же пройдем вместе с Жакобом и Моно по дороге открытия генов-регуляторов и генов-операторов. Конечно, это будет не так просто. Может быть, чтобы понять их опыты, понадобятся карандаш и бумага. Но пусть это вас не смущает. Ведь авторы открытия, в отличие от нас, не могли прочесть ни в одной книге, как поставить свой опыт.
Начнем с того, с чего начинается любая научная статья — с «постановки задачи», а затем перейдем к «материалу и методам исследований», опишем результаты и проведем «обсуждение».
Успех любого исследования определяется правильностью постановки задачи. В правильной постановке задачи, пожалуй, на первом месте стоит выбор рабочей гипотезы, на основе которой будет сконструирован эксперимент. Помните, насколько важно было Крику представить гипотетическую схему того, как читается генетическая информация в ДНК, предположить существование начальной точки чтения, непрерывность этого чтения и то, что это чтение ведется тройками нуклеотидов. Эта рабочая гипотеза и позволила авторам вести опыт.
Также в экспериментах Жакоба и Моно главным на пути к успеху был выбор верной рабочей гипотезы. Они рассуждали так. Сумма накопленных знаний о стимуляции и угнетении синтезов в клетках заставляет предположить, что в них есть какие-то выключатели, которые то запускают в ход «моторы синтезов», то выключают их. Выключатели чувствительны к соединениям, добавляемым к клеткам (индукторам). В разобранном нами примере индукции расщепления лактозы бактериальными клетками таким индуктором были различные галактозиды — вещества, не участвовавшие в самих реакциях сбраживания лактозы. Подобно этому, и в других случаях индукции химическая природа индукторов не всегда была родственна природе соединений, синтез которых возбуждался ими.
Но иногда клетки, которые раньше не отзывались на добавление к питательной среде индукторов, вдруг теряли это свойство (его называют индуцибельностью). Такая клетка становилась глухой к сигналам индукторов. И самое интересное, что эта нечувствительность к индукторам передавалась потомкам, была наследственной. А если так, то значит, механизм индуцибельности был связан каким-то образом с генетическими структурами. Это и послужило для Жакоба и Моно тем компасом, который вывел их на верную дорогу поисков. Они предложили следующую схему осуществления индукции в клетках.
По их предположению, не все гены в хромосомах равнозначны по своим функциям: есть гены, передающие информацию для синтеза ферментов (структурные), и есть гены, регулирующие активность структурных генов. Эти гены регуляторной системы и представляют собой выключатели. Но, кроме этого, Жакоб и Моно высказали предположение, что гены регуляторной системы состоят, в свою очередь, из двух различающихся разновидностей — генов-регуляторов и генов-операторов. Продукты, формирующиеся в клетке под контролем первых генов, взаимодействуют с индукторами, а уже в результате этого дается команда гену-оператору: выключить или включить работу структурных генов.
Такова была рабочая гипотеза двух французских ученых. Механизм индукции по их представлениям был прост: индуктор, входя в клетку, взаимодействует с геном-регулятором, и в результате подается команда гену-оператору; ген-оператор включает механизмы структурных генов: фабрика белковых синтезов начинает работу.
Такая гипотеза объясняла многие странные явления. Так, ученые наблюдали, что иногда повреждение клетки приводило к замыканию в цепи синтеза целого ряда ферментов (например, сразу выключались и β-галактозидаза и трансацетилаза) или, наоборот, их синтез начинал идти с неконтролируемой скоростью и на него не влияли индукторы. Иногда же нарушался синтез одного из ферментов, но зато скорость синтеза других оставалась той же, а кроме того, сохранялись неизменными способность к индукции и репрессии таких клеток.
Все из указанных типов нарушений получали объяснение на основе гипотезы Жакоба и Моно. В первом случае, по их мнению, повреждались регулирующие гены: поломка гена-регулятора приводила к неконтролируемому синтезу ферментов, они как бы теряли своего руководителя и, как лошади без седока, неслись во весь опор, не разбирая дороги — ничто не могло их остановить; повреждение же гена-оператора вообще выводило из строя все механизмы синтезов, и никакое добавление индукторов не давало эффекта, сразу все структурные гены переставали работать. Во втором случае повреждается один структурный ген, а остальные работали как прежде, так как регуляторная система функционировала нормально.
Схема Жакоба и Моно казалась простой. Но это была обманчивая простота. Гипотеза привлекала своей понятностью, она объясняла многие загадочные вопросы; но оставалось неясным, как доказать, что это не гипотеза, пусть и увлекательная, а настоящая теория, подкрепленная фактами и стоящая но почве этих фактов.
Как же показали исследователи истинность своей гипотезы?
Допустим, что в хромосоме есть ген-регулятор, который дает вещество, названное ими репрессором. Пусть этот репрессор действует на ген-оператор. При соединении оператора с репрессором происходит его замыкание, и в результате структурные гены выключаются. Если же репрессор соединяется с индуктором, введенным в клетку, оператор освобождается, и система структурных генов начинает работать. Это показано на схеме. Если такая схема справедлива, то можно предсказать, что будет в случае различных повреждений либо гена-регулятора, либо гена-оператора, либо одного из структурных генов. Суметь так выбрать различные изменения в этих генах, чтобы из их наличия вытекала с необходимостью истинность существования данных трех групп генов, и найти методы выявления изменений этих генов — вот что было во всех опытах исследователей самым трудным.
Рассмотрим по отдельности мутации каждого из указанных генов. Начнем с мутаций гена-регулятора. Очевидно, что может быть два типа таких мутаций. Первый — это мутация, ведущая к инактивации гена-регулятора или синтезируемого им репрессора. Нетрудно догадаться, что при этом наступил бы неконтролируемый синтез ферментов, управляемых этим геном, так как на оператор не действовали бы никакие репрессоры. Кроме того, синтез всех этих ферментов начал бы идти с максимальной скоростью.
Надо подчеркнуть, что в случае подобной мутации одновременно изменялась бы скорость синтеза всех ферментов, входящих в данную регулируемую систему. Индукторы не влияли бы на синтез, так как им не на что было бы действовать: репрессора больше бы не существовало в клетке. Но, несмотря на такое сложное действие, генетические методы должны были бы обнаружить в хромосоме лишь одну простую мутацию, и эта мутация на генетической карте располагалась бы в другом месте, нежели структурные гены. И, наконец, если получить диплоид, в котором один ген-регулятор изменен, а другой будет нормальным, — все станет на свои места.
Хотя один ген-регулятор в хромосоме клетки поврежден, зато второй, принесенный из бактерий донора, обеспечит выработку репрессора, и регуляция синтеза ферментов в поврежденной хромосоме будет восстановлена. Применяя методы генетического и биохимического анализа. Жакоб и Моно доказали, что могут возникнуть точечные мутации в участке хромосомы, лежащем в стороне от структурных генов. Свойства полученных мутантов полностью совпадали с теоретически предсказанными. Эти мутанты характеризовались следующими особенностями:
- синтез всех входящих в систему Lac-ферментов начинал идти с максимальной скоростью;
- изменение скорости синтеза произошло одновременно и одинаково у всех таких ферментов;
- индукторы перестали действовать.
Так был сделан первый шаг на пути к доказательству существования генов-регуляторов. Но оставался нерешенным второй вопрос: а действительно ли ген-регулятор управляет синтезом какого-то вещества, которое назвали репрессором? Такой вопрос не был праздным. Можно было бы предположить, конечно, что просто ген-регулятор влияет на ген-оператор, а индуктор действует не на репрессор, а непосредственно на ген-регулятор. Но такая простота сделала бы непонятным механизм влияния регулятора на оператор. Ведь регулятор, как доказали Жакоб и Моно, находится в стороне от структурных генов и не может непосредственно влиять на оператор, который, как они считали, тесно примыкает к структурным генам.
Итак, нужно было доказать, что репрессор существует на самом деле. Ученые нашли путь для решения и этой задачи. Раз должен быть репрессор, он должен как-нибудь проявить себя. Начался поиск мутаций, которые не разрушали бы ген-регулятор, а приводили бы к изменению синтезируемого репрессора настолько, чтобы он потерял сродство к индуктору, но сохранил способность действовать на ген-оператор. Тогда синтез всех контролируемых ферментов прекратился бы совсем в любых условиях: и при добавлении, и при изъятии индукторов. Кроме того, такие мутации стали бы, как говорят генетики, доминантными. В диплоидной клетке, в отличие от мутаций, описанных выше, синтез ферментов прекратился бы полностью, несмотря на то, что вторая хромосома, входящая в диплоид, оставалась бы нормальной.
Действительно, в случае, если бы добавлялся индуктор, он связывался бы с нормальным репрессором, а мутантный репрессор подавлял бы деятельность обоих генов-операторов. Поиск таких мутаций, «запрещающих» соединение репрессора с индуктором, увенчался успехом. Доказательство существования гена-регулятора и синтезируемого им репрессора было получено.
Теперь наступило время доказать существование гена-оператора. У этого гена также могло быть два типа мутаций. Первый — инактивация гена-оператора и вследствие этого полное отсутствие синтеза всех ферментов; второй — потеря сродства оператора к репрессору без снижения активности самого оператора. Мутации гена-оператора приводили бы к нерегулируемому синтезу ферментов. Важной особенностью таких мутаций, как видно из схемы, явилось бы то, что в диплоидном состоянии такие мутации были бы доминантными. Ведь существование в одной диплоидной клетке нормальных операторов (чувствительных к репрессору) и мутировавших операторов (нечувствительных к репрессору) не препятствовало бы функционированию последних. Такие мутации гена-оператора были обнаружены. Все они находились в другом месте хромосомы бактерии, чем мутации гена-регулятора, точнее говоря, располагались близко к структурным генам.
Теперь можно рассказать о самом интересном опыте. У гена-регулятора ученые нашли мутацию, снижавшую сродство репрессора к индуктору, являющуюся, как мы уже писали, доминантной в диплоидной клетке в паре с нормальной хромосомой и приводившую к нарушению синтеза ферментов. У гена-оператора также нашли доминантную мутацию, но она, наоборот, не снимала синтез ферментов, а вызывала нерегулируемый их синтез, так как не давала индукторам влиять на синтез ферментов.
Что будет, если в клетке будут одновременно находиться мутантный регулятор, дающий измененный репрессор, и мутантный оператор, потерявший способность к соединению с репрессором? По своим свойствам эти мутанты противоположны и, если только теория Жакоба и Моно права, то в такой клетке должен осуществляться неконтролируемый синтез ферментов. Ведь хотя репрессор и потерял сродство к индуктору и в силу этого подавил синтез, он не сумеет подавить вторую хромосому, в которой изменен оператор. На него он подействовать не сможет, и синтез будет идти нерегулируемо. Предсказание сбылось. Диплоид, собранный из двух таких доминантных мутаций, вел себя в полном согласии с теорией.
Следует упомянуть о том, что были изучены и мутации отдельных структурных генов. Как и следовало ожидать, они нарушали синтез одного из ферментов, входивших в систему Lac, но никогда не нарушали сразу всей системы. Эти мутации находились в хромосоме вне генов регуляторной системы. Таким образом, если раньше считалось, что сбраживанием лактозы управляет один ген, то при детальном изучении этого гена выяснилось, что это вовсе не ген, а целая область, состоящая из ряда генов: структурных и двух регуляторных.
Как видите, опыты Жакоба и Моно привели к установлению фундаментального факта наличия регуляторной системы в геноме организмов. На примере изученной ими системы ферментов, участвовавших в сбраживании лактозы, эти ученые смогли не только теоретически предсказать, но и экспериментально обнаружить явление регуляции белкового синтеза (вспомним, что ферменты — это белки).
Сейчас исследования по регуляции белковых синтезов идут широким фронтом. Если бы эта статья писалась всего три года назад, можно было бы указать лишь единичные примеры систем ферментов, про которые было точно известно, что они подчиняются схеме Жакоба и Моно. Спустя год были обнаружены ферментные системы, управляемые таким образом не только у бактерий, но и у других организмов, в частности у грибов. Закон, справедливый для одних из живых существ, распространяется сейчас на все более широкий диапазон представителей живого мира. И, видимо, следует признать, что явление регуляции биохимической активности клеток присуще всем организмам.