Как при естественном инфекционном процессе, так и в экспериментальных условиях клетка может быть заражена не одним, а несколькими вирусами. Поэтому при смешанной инфекции наблюдаются две различные формы взаимодействия:
- между геномами вирусов (генетические взаимодействия) — рекомбинация, множественная реактивация, пересортировка генов, кросс-реактивация, гетерозиготность;
- между продуктами генов (негенетические взаимодействия) — комплементация, интерференция, фенотипическое смешивание.
Генетические взаимодействия вирусов. Рекомбинация, или обмен генами между организмами, может быть межгенная, т. е. обмен целыми генами, и внутригенная, т. е. обмен участками внутри одного гена.
Образующийся рекомбинантный вирус обладает свойствами разных родителей и характерными легко регистрируемыми признаками. Для получения рекомбинантов используют штаммы, содержащие два маркера или больше. Тест рекомбинации применяют для генетических исследований вирусов. С его помощью возможно построение генетических карт. По ним определяют, в каких участках генома вируса произошли мутации, и условные единицы измерения расстояния между разными мутациями.
Путем рекомбинации можно передавать ряд признаков: гемагглютинирующую активность; ингибиторо — и терморезистентность; патогенность для мышей; активность размножения в куриных эмбрионах; ферментативную, иммуногенную и цитопатоген- ную активности. Одни признаки (ингибиторорезистентность, гемагглютинирующая активность, инфекционность, иммунологическая активность) передаются регулярно, другие (терморезистентность, патогенность, ферментативная активность и ингибиторочувствительность) — нерегулярно.
Рекомбинанты вирусов позвоночных удается получить только при скрещивании близких по свойствам вирусов, принадлежащих к одному роду. Частота возникновения их широко варьирует и существенно зависит от используемой биологической системы (клетки, вирус), а также от того, какое наследственное свойство стремятся рекомбинировать. Рекомбинация с высокой частотой наблюдается у PHK-содержащих вирусов и у ДНК-содержащих вирусов, геном которых представлен двуспиральной ДНК.
В экспериментальных условиях гибридные формы можно получить одним из четырех способов:
1) при совместном культивировании двух жизнеспособных вирусов и введении их в чувствительную систему одновременно или в разное время. Например, опыт Бернета по совместному культивированию в мозге мышей нейротропного (Nws) и пневмотропного (MEL) штаммов вируса гриппа типа А, которые отличались между собой нейровирулентностью, антигенными и другими свойствами. В результате одновременной репродукции из популяций потомства выделили методом предельных разведений гибриды, антигенно сходные с пневмотропным штаммом, но обладающие разной степенью нейровирулентности для мышей, заражаемых в мозг. Аналогичные гибридные формы возникают при одновременном культивировании этих же штаммов в куриных эмбрионах;
2) при введении в чувствительную систему живого и инактивированного (УФ-лучи, нагревание) вируса. Например, гибриды вируса гриппа совмещали признаки того и другого вируса, причем они возникали как при одновременном введении, так и при раздельном — вначале инактивированного, а через 2—3 дня живого вируса. При гибридизации инактивированного УФ-лучами вируса гриппа типа А, образующего бляшки на культуре куримых фибробластов, с инфекционным вирусом гриппа того же типа, не обладавшим такой способностью, были получены бляшкообразующие рекомбинации.
При совместном культивировании инактивированного и живого вируса передача некоторых признаков носит коррелятивный характер, т. е. приобретение одного свойства влечет за собой одновременное появление другого. Так, вместе с приобретением ингибиторорезистентности наблюдалось значительное усиление активности размножения вируса в куриных эмбрионах и патогенности для белых мышей;
3) при совместном культивировании вируса и вирусной нуклеиновой кислоты, выделенной из другого штамма;
4) в случаях одновременного введения в культуру клеток разных нуклеиновых кислот, соответствующих двум разновидностям вирусов.
Примеры рекомбинации.
1. Доказана возможность возникновения рекомбинантов между вирусами гриппа животных и человека не только в опытах in vitro, но и в организме животных, что имеет прямое отношение к объяснению причин возникновений эпидемий гриппа. Получен гибрид в результате рекомбинации между вирусами гриппа А — лошадиным 1/56 и человеческим А2. Рекомбинант содержал гемагглютинин лошадиного вируса и нейраминидазу человеческого штамма.
2. Доказана рекомбинация у вирусов полиомиелита типа 1 и ящура (между подтиповыми штаммами).
3. Гибридизация ДНК-вирусов была впервые проведена с вирусами оспы кролика и осповакцины, а также с генетически различными штаммами вируса обычного герпеса. Рекомбинанты отличались по величине очагов поражений на хорионаллантоисной оболочке и вирулентности для мышей. Гибридизация лучше удается между близкими видами и разновидностями (например, со штаммами кроличьей оспы и дермальной осповакцины), чем между далекими видами (оспы и эктромелии), и совсем не удавалось получить гибриды при скрещивании оспенных вирусов с вирусами других семейств.
4. Установлена возможность наследственной передачи вирусу истинной чумы птиц (гриппа птиц А1) резистентности к амантадину путем межвидовой рекомбинации с устойчивым к этому агенту вирусом гриппа АО.
Гибридизация (рекомбинация) свойственна всем вирусам, однако в ее обнаружении имеются определенные трудности. Условия обнаружения рекомбинации:
- два родительских вируса имеют различные легко выявляемые генетические маркеры. Для этой цели используют маркеры генетические (мутации), физические (родители имеют разную плотность или радиоактивность) и маркирование с помощью модификации, индуцированной хозяином;
- обязательное проникновение в клетку обоих вирусов, участвующих в рекомбинации. Для этого используют высокие множественности заражения двумя родительскими типами, которые берут обычно в равных количествах. Конкретная методика проведения рекомбинации вирусов зависит в каждом случае от их типа.
Длительность рекомбинации определяется длительностью цикла развития вируса, температурой (оптимальной температурой развития двух вирусных компонентов), выбором клеточной системы — возможностью одновременного развития в ней обоих вирусов без подавления механизмами клетки-хозяина и без влияния на потомство, что может исказить результаты рекомбинации.
Различают три вида рекомбинации.
1. Общая рекомбинация происходит между гомологичными последовательностями нуклеиновых кислот, обычно в процессе их синтеза. При этом цепи молекул нуклеиновых кислот расплетаются двуспиральной ДНК (или двуспиральной репликативной формой РНК); замыкаются водородные связи между комплементарными последовательностями двух цепей, принадлежащих разным молекулам. Формируется фигура рекомбинационного креста — структура Холлидея. Зона замыкания водородных связей между цепями разных молекул называется гетеродуплексом. У Е. coli с гетеродуплексом связывается белок RecA, который является многофункциональным ферментом. RecA расплетает двойные спирали рекомбинирующих молекул и способствует спариванию оснований, раздвигая таким образом структуру Холлидея в обе стороны от места начала гетеродуплекса. В то же время АТФ-зависимая эндонуклеаза вносит односпиральиые разрывы, разделяя молекулы, обменявшиеся участками. После продвижения структуры Холидея по длине молекулы другой фермент лигаза соединяет разрывы, и рекомбинировавшие молекулы расходятся. Такова модель гомологической рекомбинации Холлидея, которая реализуется у вирусов эукариотов (если нуклеиновые кислоты репродуцируются и клеточном ядре), а также у фагов и бактерий. В этом случае происходит симметричный обмен фрагментами (например, одним и тем же геном).
Оба типа продуктов рекомбинации равновероятны.
Однако обмен может быть и несимметричным. Такой обмен называют рекомбинацией по модели Мезельсона—Рэддинга. Процесс начинается с внесения АТФ-зависимой эндонуклеазой односпирального разрыва в одну из рекомбинирующих молекул. Затем происходит разрыв водородных связей с 3′-конца от места разрыва, и формируется односпиральный фрагмент. 5′-конец фрагмента свободен, а 3′-конец находится в составе одной из рекомбинирующих молекул, именуемой донорской молекулой. В молекуле второго партнера по рекомбинации происходит расплетание двойной спирали с образованием двух односпиральных петель. В зоне комплементарности происходит спаривание 5′-конца цепи одной из рекомбинирующих молекул с одной из односпиральных петель другой молекулы. Далее зона замыкания водородных связей в гетеродуплексе расширяется, затем односпиральный участок донорской молекулы разрезается нуклеазой, специфичной в отношении односпиральной нуклеиновой кислоты. В результате донорская молекула утрачивает участок одной из цепей нуклеиновой кислоты, который затем восстанавливается полимеразой на матрице второй цепи. Акцепторная молекула приобретает участок «чужой» молекулы, который находится в составе двойной спирали, а соответствующий «свой» участок связан с ней в виде односпиральной петли, которая гидролизуется нуклеазами. Процесс завершают лигазы, ликвидирующие в обеих молекулах односпиральные разрывы, и система репарации, ликвидирующая неправильно спаренные нуклеотиды. В этом случае происходит асимметричный обмен фрагментами, в результате которого информация донорской молекулы входит в состав донорской и акцепторной молекулы, а информация акцепторной молекулы утрачивается. Такой механизм обнаружен пока только у эукариотических клеток и репродуцирующихся в них вирусов.
2. Сайтспецифическая рекомбинация происходит между молекулами нуклеиновых кислот, имеющими гомологичные последовательности только на несколько нуклеотидов (15—31 нуклеотид). Например, процессы интеграции одного генома в другой (интеграция генома ретровирусов в геном клетки, профага — в бактериальную хромосому, фага — в плазмиду, вирусного генома — в вирусный геном) можно рассматривать как частный случай рекомбинации этого типа.
Рекомбинация данного вида изучена менее подробно. Известно, что при сайтспецифической рекомбинации обмен происходит асимметрично и начинается с зоны, содержащей два коротких взаимокомплементарных участка молекулы-акцептора и молекулы-донора. В молекуле-акцепторе эти участки непосредственно соседствуют друг с другом, а в молекуле-доноре расположены на концах передаваемого в ходе рекомбинации участка. Процесс начинается с расплетания обеих молекул. Затем замыкаются водородные связи в зоне комплементарности. В результате образуется структура, состоящая из односпиральной петли молекулы-акцептора и соединенной с ней кольцевой петли участка молекулы-донора. Эта кольцевая петля может быть ковалентно замкнутой и включать весь геном, как это имеет место у профагов. Затем в петлю внутри сайта вносится односпиральный разрыв, и участок донорской молекулы оказывается соединенным с концами разрезанной молекулы-акцептора водородными связями. Односпиральные участки молекулы-акцептора спариваются водородными связями со второй цепью, а участок акцептора на ней образует петлю. На матрице этой петли полимеразы достраивают комплементарный участок, после чего акцепторная молекула, став двуспиральной, несет информацию молекулы-донора. В отличие от случая в модели Мезельсона—Рэддинга молекула-донор не утрачивает последовательностей нуклеотидов. Однако информация, кодируемая сайтом, в который произошла встройка, может утратиться или изменить смысл.
3. Незаконная рекомбинация происходит между молекулами, не имеющими каких-либо сходных последовательностей нуклеотидов. Например, между геномами иридо- и поксвирусов. Незаконная рекомбинация происходит только при внесении в обе рекомбинирующие молекулы двуспиральных разрывов с последующим перекрестным замыканием этих разрывов. Можно предположить, что большую роль играют ферменты эндонуклеазы, разрезающие нуклеиновые кислоты с образованием липких концов, которые склонны к самопроизвольному замыканию путем образования водородных связей. Если замыкание произошло между липкими концами двух разных молекул, а оставшиеся односпиральные разрывы были ликвидированы лигазами, это будет означать, что произошла незаконная рекомбинация.
Во всех трех случаях под рекомбинацией понимают симметричный или асимметричный обмен участками между молекулами нуклеиновых кислот.
Множественная реактивация. Вид генетического взаимодействия, который наблюдается при заражении клетки несколькими вирионами с поврежденным геном. При этом функцию «пострадавшего» гена может выполнять вирус, у которого этот ген не поврежден. Этот феномен был вначале обнаружен на бактериофагах.
В основе множественной реактивации лежит кооперативный процесс: вирионы с поражением отдельных генов дополняют друг друга путем генетической рекомбинации, в результате репродуцируется исходный неповрежденный вирус.
Для множественной реактивации имеет значение:
- расстояние внутри клетки между вирионами, геном которых поврежден;
- характер используемой культуры клеток.
Эффективность процесса зависит от многих причин: степени повреждения генома вирионов, числа проникших в клетку вирионов, концентрации вирионов в определенных участках клетки, аутоинтерференции поврежденных вирионов.
Например, вирус болезни Ауески, инактивированный УФ-лучами, может быть реактивирован (активен) в первичной культуре клеток куриного эмбриона. Это связано со способностью клеток куриного эмбриона выводить индуцированные УФ-димеры тимина. В противоположность этому клетки почки кролика не дают феномена реактивации, так как не обладают элиминирующей особенностью в отношении димеров тимина.
Кросс-реактивация. Реактивация при скрещивании (или спасение маркера) — это феномен, сходный с множественной реактивацией, но отличный тем, что один из вирусов используют в нативном (неизмененном) виде, другой — инактивируют путем частичного разрушения генетического материала (действие УФ, температуры и др.). При этом наблюдаются два различных явления:
- реактивация (восстановление активности) инактивированного генома неповрежденным геномом вируса, т. е. сохраняются неповрежденные участки нуклеиновой кислоты инактивированного вируса;
- взаимная реактивация двух инактивированных геномов.
В результате могут возникать рекомбинанты со свойствами обоих использованных в опыте штаммов. Этот тип рекомбинации хорошо изучен в опытах с фагами. При кросс-реактивации гораздо легче получить рекомбинантные формы, чем при скрещивании двух нативных вирусов.
При кросс-реактивации используют обычно два штамма вируса с геномами, маркированными по-разному. По предложению Адаме, с начала 1960-х годов разделено значение терминов: модель Лурия называется «спасение маркера»; модель Апплеби — «кроссреактивация»; появление полноценного потомства после заражения клетки немаркированным вирусом с частично инактивированным геномом — «множественная реактивация».
Кросс-реактивация имеет место в тех случаях, когда инактивированный геном вводится в клетку до введения неповрежденного генома вируса или при их одновременном введении. Известны примеры кросс-реактивации при введении инактивированного генома за 24—48 ч и за 56—72 ч до введения неповрежденного генома.
Пересортировка генов. Вид генетического взаимодействия, который наблюдается среди вирусов с фрагментированным геном (рео-, арена-, бунья-, ортомиксовирусы). Образуются определенные группировки (констелляции, или созвездия) генов, которые в данной системе клеток более стойкие, и вирус более жизнеспособен. Образующиеся при этом гибридные формы вирусов называют реассортантами.
Чаще всего и интенсивнее пересортировка генов происходит с вирусами гриппа А (ортомиксовирусы). Гибридные формы вирусов гриппа получают при совместном культивировании вирусов с разными генами гемагглютинина и нейраминидазы, после чего из общего потомства путем нейтрализации соответствующих антигенов можно выделить интересующие варианты.
Гетерозиготность. Феномен, наблюдаемый при репродукции в клетке нескольких частиц вирусов, отличающихся наследственными признаками. В результате в клетке могут образовываться вирионы, содержащие полный геном одного родительского штамма и часть генома (или полный геном) другого вируса (диплоидные или полиплоидные вирионы). Образующиеся при этом гибридные формы вирусов называются гетерозиготы. В отличие от обычных гомозиготных частиц все потомство обладает одинаковыми свойствами. Феномен гетерозиготности обнаружен в опытах с вирусами гриппа и болезни Ньюкасла.
Объединение генетического материала в одной вирусной частице не наследуется, но позволяет такому вириону дать потомство, в котором будет содержаться часть вирусных частиц со свойствами одного, а часть — другого родителя.
Механизм возникновения гетерозиготных штаммов изучен на бактериофагах. Показано, что в случае нагревания ДНК при температуре, близкой к 100 °С, двойная ее спираль диссоциирует (денатурирует) на две цепочки; при последующем медленном охлаждении цепи могут вновь соединяться. Если в растворе присутствуют молекулы двух различных типов ДНК, то могут произойти взаимообмен цепочками нуклеиновых кислот и образование смешанных молекул ДНК со свойствами, которые характерны для каждого из исходных вирусов. Как образуются гетерозиготные формы у вирусов, содержащих односпиральную РНК, не ясно.
Транскапсидация. Феномен, наблюдаемый при репродукции в клетке нескольких неродственных вирусов. При этом часть чужеродного генетического материала, заключенного внутри капсида одного неродственного вируса, способна переноситься (в стабильной форме) в чувствительные к основному вирусу клетки.
Например, этот феномен наблюдается при одновременном выращивании в клетках аденовируса и вируса SV40 обезьян. В инфицированных клетках обезьян аденовирус человека вызывает синтез иРНК, вирусоспецифической ДНК и вирусоспецифического опухолевого антигена, но не способен индуцировать синтез вирусных белков, из которых построен капсид аденовируса. В силу этого дефекта полноценный инфекционный аденовирус не формируется (не завершается последняя стадия репродукции). При культивировании обоих вирусов (аденовируса и SV40) появляются вирионы, которым присущи как антигены аденовируса А7, так и SV40. Такие гибриды являются аденовирусом, в капсиде которого содержится геном вируса SV40, сцепленный с геномом аденовируса, свидетельствующий о генетическом взаимодействии разных видов вирусов.
Негенетические взаимодействия вирусов. Фенотипическое смешивание. Наблюдается при одновременной репродукции двух генетически различных вирусов; проявляется образованием вирионов с генотипом одного из исходных штаммов, но антигенными свойствами обоих вирусов. При данном виде взаимодействия объединяются только структурные белки вирусов, обмена информацией между их нуклеиновыми кислотами не происходит. Формы со смешанным фенотипом нейтрализуются сыворотками против обоих исходных штаммов, так как в оболочке полученных вирусов имеются структурные белки обоих родительских штаммов. Такие вирионы воспроизводят в первом поколении признаки того штамма, нуклеиновую кислоту которого они содержат.
Явление фенотипического смешивания наблюдали у бактериофагов Т2 и Т4, у вирусов животных и человека (болезни Ньюкасла, гриппа, полиомиелита, Коксаки, арбовирусов группы А).
Негенетическая реактивация. При таком виде взаимодействия инактивированный вирус А в результате денатурации структурных белков (депротеинизации) приобретает способность размножаться благодаря активности фермента другого родственного вируса Б. Катализатором может быть не только жизнеспособный вирус Б, но и вирус В, ДНК которого повреждена и не способна реплицироваться (воспроизводиться). Введение депротеинизирующего фермента в культуру клеток, которая инфицирована инактивированным вирусом, ведет к освобождению ДНК вирионов инактивированного вируса и запускает полноценный цикл репродукции.
Впервые явление негенетической реактивации наблюдали Берри и Дедрик в 1936 г. между инактивированным вирусом миксомы и живым вирусом фибромы. Наиболее широко изучен феномен у поксвирусов.
Комплементация. Наблюдается в тех случаях, когда при мутации в геноме вируса возникают повреждения, и он лишается способности самостоятельной репродукции. Если в клетку проникают два дефектных штамма, у одного из которых повреждения локализованы в гене, ответственном за синтез ранних белков (ферментов), а у другого штамма — в гене, ответственном за синтез структурных белков, то каждый из них может взаимно использовать фермент, синтез которого индуцируется другим штаммом. В результате такой кооперации два дефектных вируса, не способных репродуцироваться поодиночке, при двойной инфекции проходят полный цикл репродукции. Отличие комплементации от генетической рекомбинации заключается в отсутствии обмена генетическим материалом.
Комплементация может быть:
- односторонняя, когда один вирус обеспечивает другого необходимыми для его репродукции продуктами. Стимулирующий репродукцию вирус называется «вирус-помощник», а вирус, репродуцирующийся только в присутствии помощника, — «вирус — сателлит»;
- двусторонняя, когда каждый из вирусов не способен к самостоятельной репродукции.
Этот вид взаимодействия широко распространен как между родственными, так и неродственными вирусами и тесно связан с дефектностью вирусов. Поскольку в популяции помимо стандартных присутствуют дефектные неинфекционные вирусные частицы, утратившие часть генетического материала, комплементация имеет место в инфекционном цикле многих вирусов. Члены популяции снабжают друг друга продуктами генов, которые дефектны у партнеров (негенетическая реактивация).
Примеры комплементации.
1. Вирус саркомы Рауса не может индуцировать синтез структурных белков, а для строения своей оболочки использует белки вируса лейкоза птиц. В присутствии последнего из зараженной вирусом саркомы Рауса культуры клеток куриных фибробластов выделяется вирус Рауса.
2. Вирусом-сателлитом считают вирус парагриппа типа 3 по отношению к вирусу болезни Ньюкасла в культуре клеток почек обезьян, вирус Сендай — по отношению к полиовирусу в культуре фибробластов и клеток эмбрионов хомяка.
3. Комплементация встречается и у неродственных вирусов; наиболее часто у представителей аденовирусов. В одних системах аденовирусы действуют как дефектные вирусы, в других — как помощники. Например, в культуре клеток почек макак-резусов аденовирусы репродуцируются только в присутствии вируса SV40, который является в данном случае вирусом-помощником. В других системах сами аденовирусы действуют как вирусы-помощники, а вирусом-сателлитом является аденоассоциированный вирус, относящийся к парвовирусам. Репродукция этого вируса полностью зависит от действия аденовирусов.
4. Вирус гепатита В является помощником для 8-агента, который покрывается его наружным белком — HBs-антигеном. Сочетание обоих вирусов обнаружено при наиболее тяжелых формах гепатита.
Возможна не только межцистронная, но и внутрицистронная комплементация в том случае, если один ген кодирует несколько белков.