Пластичность
При изучении влияния, оказываемого условиями среды на развитие грибов, необходимо иметь в виду высокую пластичность, свойственную этим организмам.
Одним из примеров подобной пластичности может служить способность грибов приспосабливаться к неблагоприятным условиям существования, вырабатывать исключительную устойчивость, например, к токсическим веществам, к неблагоприятной концентрации водородных ионов и т. п.
Грибы обладают высокой степенью устойчивости к различного рода облучениям. В центре атомных исследований в Гренобле выделили гриб Phialophora atra v. Beyma из растворов сахаров на тяжелой воде, а также с внутренней стенки атомного котла. Гриб выдерживал в течение длительного времени облучение 500 р/ч, т. е. дозу, считавшуюся для микроорганизмов гибельной. О высокой адаптивной способности грибов свидетельствует также присутствие гифомицетов (14 видов) в воде серорадоновых источников, характеризующихся значительным содержанием эманации радия (до 59 ммккюри). О чрезвычайно высокой степени выносливости микроорганизмов говорят и наблюдения, проведенные в связи с космическими исследованиями. В трубках, содержащих культуральную среду и доставленных с Луны, были обнаружены колонии Streptococcus mitis, которые выжили в условиях вакуума на Луне в течение 950 дней.
Грибы обладают также способностью адаптироваться к высоким концентрациям металлов. Из солевых разработок в Японии выделен гриб — галофит Rhodotorula glutinis, который рос на среде, содержащей 3М KCl или NaCl.
Пластичностью грибов объясняются явления адаптации к фунгицидным веществам. С течением времени применяющиеся фунгициды перестают действовать на возбудителей болезни.
Важным свойством патогенных микроорганизмов, позволяющим им легко приспосабливаться к изменяющимся условиям существования, является также их способность образовывать так называемые «адаптивные», или индуцированные, ферменты. Они могут вырабатываться как под влиянием условий питания, так и под воздействием физических факторов среды, таких, как температура, свет и т. д. Способность микроорганизмов изменять свойства ферментативного аппарата под влиянием окружающих условий, несомненно, имеет большое значение для пластичности этих организмов, для их способности к выживанию в широких пределах колебания факторов среды. Образование адаптивных ферментов помогает патогенным микроорганизмам приспосабливаться к новым для них растениям.
Пластичность и приспособляемость — важные свойства, с помощью которых патогенные грибы преодолевают сопротивляемость растительных тканей. В результате приспособляемости выщепляются новые расы, способные поражать ранее устойчивые сорта. Селекционерам хорошо известно, что иммунные к какому-либо заболеванию сорта культурных растений сохраняют свою устойчивость, как правило, лишь немного лет. Потеря устойчивости такими сортами объясняется не изменением природы сорта, а появлением новой расы паразита.
В результате приспособляемости паразитических микроорганизмов выводимые селекционерами устойчивые сорта различных культурных растений обычно теряют устойчивость за сравнительно небольшое число лет, что заставляет не прекращать селекционную работу и выводить все новые устойчивые сорта.
Ферментативный аппарат
Вопрос о каталитических системах и химических соединениях, синтезируемых патогенными микроорганизмами и обусловливающих их повреждающее действие, включая и гибель зеленого растения, изучают на протяжении многих десятков лет. Накопленные в этих исследованиях материалы свидетельствуют о большой зависимости свойств патогенов от типа их питания (сапрофиты, полупаразиты, облигатные паразиты и т. п.), а также от состава питательной среды. В число этих факторов должны быть включены и свойства растения, на котором они паразитируют.
Мы уже отмечали широко распространенную у патогенных микроорганизмов способность к образованию адаптивных ферментов. Этим термином обозначают каталитические системы, биосинтез которых вызывают те или иные компоненты питательной смеси. Причем превращения этих соединений регулируют те самые ферменты, под воздействием которых они образуются. Механизмы этого индуцирующего эффекта окончательно не выяснены. Согласно наиболее принятым в настоящее время взглядам, соотношения между различными белками, включая и каталитически активные белки клетки (ферменты), регулируют две группы специфических агентов живой клетки — репрессоры и дерепрессоры. Функции репрессоров — подавление процессов биосинтеза белков, тогда как дерепрессоры снимают ингибирующее действие репрессоров. Под влиянием дерепрессоров в клетке либо стимулируется биосинтез ферментов, ранее синтезировавшихся в незначительных количествах, либо создаются условия для синтеза ферментов, которых до этого в клетке совсем не было (синтез de novo).
В роли репрессоров и дерепрессоров могут выступать многие агенты различной химической и физической природы, включая компоненты питательной смеси, метаболиты самих микроорганизмов, а также продукты обмена, образующиеся в инфицированных клетках растения-хозяина в результате воздействия продуктов жизнедеятельности возбудителя. В частности, ими могут служить продукты взаимодействия протаминов и гистонов с полианионами, образующимися в зараженной клетке в результате гидролиза пектинов и нуклеиновых кислот. Проникая в ядро, они воздействуют на аппарат, программирующий биосинтез белков.
В целом можно считать установленным, что возбудители заболеваний растений вооружены мощным ферментативным аппаратом. С участием его компонентов могут осуществляться превращения практически всех содержащихся в тканях зеленого растения соединений. Это относится к различным группам гидролитических ферментов, включая и катализаторы, участвующие в разложении элементов покровных тканей растения (целлюлоза, гемицеллюлозы, пектиновые вещества, соединения группы лигнинов и их производных и др.). При участии этих ферментов преодолеваются механические барьеры на пути прорастающих спор и становятся осуществимыми первые этапы заражения — внедрение паразита внутрь клетки хозяина, установление непосредственного интимного контакта и взаимодействия между ним и протоплазмой клетки. Фитопатогенные микроорганизмы располагают обширным наборов протеолетических ферментов, ферментами нуклеинового обмена, эстеразами, глюкозидазами, ферментами, расщепляющими полимерные формы углеводов и т. д.
Весьма сложен состав ферментов окислительно-восстановительного комплекса. В нем широко представлены системы активации кислорода и водорода (оксидазы и дегидрогеназы), достаточно сложный комплекс коферментов пиридиновой и флавиновой природы, системы переносчиков, участвующих в транспорте электронов и т. д. Фитопатогены располагают также полноценными системами, связанными с процессами окислительного фосфорилирования и синтеза АТФ. Следует подчеркнуть вместе с тем хорошо выраженную у микроорганизмов динамичность отдельных ферментных систем и энзиматического аппарата в целом. Именно этим и обусловлена характерная для микроорганизмов пластичность, способность к адаптации, к приспособительной изменчивости свойств, чем, в свою очередь, обусловлена их способность использовать в качестве энергетического и пластического материала самые разнообразные соединения.
Токсины
К основным средствам воздействия патогена на ткани растения-хозяина принято относить сложный комплекс соединений, объединяемых термином «токсины». Как известно, в медицинской и ветеринарной практике токсином называют индивидуальные соединения, специфические для определенных патогенных бактерий, вызывающих соответствующее заболевание организма. В фитопатологии этот термин обычно относят не к какому-либо индивидуальному веществу, а к комплексу соединений, являющихся продуктами обмена возбудителя и выделяемых им при выращивании на синтетической питательной среде, а также при внедрении в живую клетку хозяина. Учитывая зависимость метаболизма патогена от состава питательной среды, нетрудно видеть, что состав токсина в том и другом случаях не может оставаться одним и тем же.
Некоторые авторы включают в понятие «токсин» также соединения, которые синтезируются клетками самого хозяина под влиянием внедрившегося в них патогена. Эту точку зрения последовательно развивает английский ученый Вуд. Он считает, что токсином следует называть комплекс соединений инфицированной клетки, способных нарушать нормальное состояние и функции протоплазмы и всех содержащихся в ней каталитических систем и физиологически активных соединений. Вопрос о химической природе и механизме действия веществ, входящих в комплекс токсинов, весьма сложный и все еще слабо изучен.
Можно считать лишь установленным, что токсическим действием обладают соединения самой различной химической природы. К ним относятся разнообразные органические кислоты (щавелевая, лимонная, виннокаменная, фумаровая, а также гликолевая, глиоксилевая, молочная и др.), представляющие собой промежуточные продукты кислородного дыхания, либо конечные продукты брожения. Наряду с этими кислотами, действие которых, как правило, неспецифично, фитопатогенные грибы синтезируют кислоты, обладающие весьма высокой и притом специфической физиологической активностью. Примером может служить альтернариевая кислота, подавляющая прорастание семян и растений семейства пасленовых, фомовая кислота, выделенная из культурального фильтрата гриба Phoma medicaginis, подавляющая прорастание семян льна, люцерны, рапса, крессалата и др. Физиологическое действие этой кислоты основано главным образом на подавлении функции некоторых ферментов из группы дегидрогеназ.
Весьма активным токсическим действием обладают некоторые белковые соединения (например, альбумины) и в особенности продукты их распада (полипептиды, аминокислоты, аммиак, амиды, триметиламин и др.). Соединения этой группы ответственны большей частью за образование в инфицированных тканях некротических пятен. Токсическое воздействие на ткани растения оказывают также некоторые синтезируемые патогенами полисахариды. Они подавляют рост, процессы биосинтеза хлорофилла, вызывают увядание тканей, служат причиной образования некротических пятен и т. п. Как правило, токсическое действие перечисленных выше соединений не отличается строгой специфичностью, а зачастую и вовсе неспецифично.
Наряду с этим известен ряд соединений, токсическое действие которых в той или иной мере специфично. Так, к числу высокотоксичных соединений специфического характера должна быть отнесена фузариновая кислота и обычно сопутствующие ей дипептиды ликомаразмин и вазинфускарин.
Биосинтез этих соединений характерен для грибов рода Fusarium — возбудителей болезни увядания большого числа различных растений. Доказано, что в основе их токсического действия лежит нарушение проницаемости биомембран, а также подавление функций важнейшей группы ферментов, связанных с энергообменом клетки (главным образом производных порфирина). Таковы пероксидаза, цитохромоксидаза и др. В результате возникают вторичные эффекты (задержка роста в первую очередь корней, образование некрозов на кончиках листьев, резкие нарушения водообмена, энергообмена, формирование и функционирование фотосинтетического аппарата и др.).
Сильным токсическим действием обладают и некоторые полипептиды, воздействующие на системы дыхания, ультраструктуру протопласта и органоидов, на молекулярную организацию мембранных образований и обусловленную этим проницаемость последних и т. д.
Уже из этого краткого обзора следует, что фитопатогенные микроорганизмы обладают обширным арсеналом средств воздействия на растение-хозяина, направленных на общее нарушение нормального для его тканей течения процессов обмена веществ.
Природа патогенности
Чем же обусловлена патогенность микроорганизмов, их способность поражать ткани высших растений, служить причиной различных заболеваний и даже полной их гибели?
Исходя из данных современной науки, вполне естественно полагать, что в основе повреждающего действия паразитарных грибов и бактерий лежат вызываемые ими нарушения нормального хода процессов обмена веществ в тканях растения, в которые они внедрились. Вместе с тем характер и сила воздействия паразитов зависят от их общей физиологической активности. Именно она обусловливает их вирулентность, патогенность. Следует иметь в виду, что по этому признаку различаются не только виды микроорганизмов, но и штаммы и физиологические расы, входящие в состав одного и того же вида.
Вопрос о причинах, обусловливающих различную патогенность отдельных рас и штаммов возбудителей заболевания, имеет большое не только теоретическое, но и практическое значение. Ведь один из наиболее действенных и надежных путей борьбы с паразитарными микроорганизмами состоит в создании устойчивых (иммунных) к болезням форм и сортов культурных растений. Обычно выведенные селекционерами новые гибриды и сорта высевают на так называемые инфекционные, или провокационные, фоны. Этим термином обозначают специальные полевые участки, на которых искусственно создана очень высокая зараженность возбудителями соответствующих заболеваний.
Растения, сохранившиеся после такого трудного испытания незараженными, оставшиеся здоровыми, селекционеры с полным основанием относят к категории устойчивых, иммунных. Эти растения и отбирают как родоначальников для дальнейшего размножения. Необходимо, однако, иметь в виду, что такой метод селекции может быть эффективным только в случае, если достаточно хорошо изучены свойства штаммов и рас микроорганизмов, которыми «нагружена» почва инфекционных фонов. Должны быть известны такие показатели, как физиологическая активность, вирулентность и патогенность рас и штаммов возбудителей, которые входят в состав инфекционной нагрузки.
Эти знания необходимы для того, чтобы при организации провокационных фонов селекционеры и фитопатологи использовали именно те физиологические формы возбудителей, по отношению к которым в первую очередь должны быть устойчивы выводимые ими новые формы культурных растений. Таковы причины, которые определяют интенсивную разработку советскими, а также зарубежными исследователями вопроса о внутренней природе и особенностях обмена веществ, ответственных за тот или иной уровень патогенности возбудителей и механизм их действия на организм растения-хозяина.
Эти исследования проводят в различных направлениях. Одно из них, получившее широкое развитие в последние годы, состоит в сравнительном изучении энерговооруженности штаммов и рас возбудителей, различающихся по уровню вирулентности. Так, сотрудники кафедры физиологии растений Московского университета Н. В. Гужова и Е. Р. Карташова детально изучили различия в структуре окислительного аппарата у двух различающихся по вирулентности штаммов гриба фузариума, вызывающего так называемую болезнь увядания (или вилт) у хлопчатника.
Штамм № 15 характеризуется высокой вирулентностью, тогда как штамм № 61 авирулентен и заболеваний хлопчатника практически не вызывает. Оказалось, что в окислительной системе вирулентного штамма гриба значительное место занимают ферменты, в молекулах которых содержится атом железа. Активность этих ферментов в 2—3 раза выше у этого штамма, чем у авирулентного. Для вирулентного штамма характерна также повышенная активность ферментов, молекула которых по химической природе относится к производным рибофлавина (витамина В2).
Для выяснения причин этих различий были изучены особенности реакции двух штаммов грибов на количество содержащегося в питательной среде железа, ибо железо относится к числу основных регуляторов биосинтеза металлосодержащих окислительных ферментов порфириновой природы. Проведенные опыты показали, что при изменении в среде содержания железа у вирулентного штамма гриба фузариум общее количество порфиринов и активность железосодержащих ферментов практически не изменялись. Что касается авирулентного штамма, то при увеличении содержания железа в питательной среде эти показатели у него возрастали в 2 раза и более.
Следовательно, авирулентный штамм не способен использовать малые дозы железа, ибо в этих условиях у него подавляются процессы образования железосодержащих ферментов. При выращивании же на среде с содержанием железа в 5—10 раз большим, он по активности металлоферментов и другим показателям приближается к вирулентному. Соответственно возрастает при этом и вирулентность гриба.
С этими данными согласуются результаты, полученные советским ученым З. Э. Беккер. Она показала, что механизм токсического действия фузариновой кислоты состоит в блокировании в инфицированной клетке окислительных ферментов, молекулы которых строятся при участии производных витаминов группы В. Активность окислительных ферментов служит лишь косвенным показателем энергетического обмена живой клетки. Достоверное представление об эффективности этой важнейшей стороны клеточного обмена веществ дают лишь непосредственные измерения количеств энергии, которые высвобождаются в ходе окисления органических веществ и накопляются в форме богатых энергией соединений.
Наиболее важным представителем соединений этого типа является аденозинтрифосфорная кислота (АТФ). Процесс образования АТФ при окислении различных органических веществ называется окислительным фосфорилированием. АТФ — это сложное органическое вещество, в котором две частицы фосфорной кислоты соединены с остальной частью молекулы посредством богатых энергией (макроэргических) связей. Содержащаяся в этих химических связях энергия легко мобилизуема и используется живой клеткой буквально во всех проявлениях жизнедеятельности, в ходе всех без исключения процессов, требующих затраты энергии. Таким образом, АТФ представляет собой, по существу, универсальную форму биологического «горючего» живой клетки. Это энергетическая валюта клетки, которой она расплачивается при поглощении и передвижении веществ, в процессах роста и развития, движения и т. д.
Исследования, проведенные на кафедре физиологии растений МГУ, убеждают в том, что вирулентные штаммы паразитов характеризуются не только более высокой активностью определенных групп окислительных ферментов, но и более эффективным использованием продуцируемой в ходе этих процессов энергии. Так, на примере фузариум Н. В. Гужова показала, что окислительное фосфорилирование клетками мицелия у вирулентного штамма гриба протекает на 30—40% более интенсивно, чем у авирулентного. Соответственно более высоким является содержание АТФ в мицелии вирулентного штамма. Столь же четкие закономерности установлены при исследовании особенностей энергообмена у различающихся по вирулентности штаммов другого возбудителя вилта хлопчатника — гриба Вертициллиум далиа.
Л. А. Воронков и И. В. Живописцева установили, что активность ключевых ферментов энергообмена и в мицелии и в особенности в митохондриях вирулентного штамма гриба в 1,5—2 раза выше, чем у авирулентного. Соответственно значительно более высокой является у вирулентного штамма и величина общего энергетического заряда, который наиболее четко отражает уровень энерговооруженности живой клетки. Мощная, эффективно функционирующая система энергообмена несомненно служит одним из факторов, обусловливающих высокую физиологическую активность возбудителей заболевания, их вирулентность и патогенность. Нет сомнений в том, что этот показатель отнюдь не единственный и что различия между штаммами не ограничиваются параметрами энергообмена.
Сверхслабое свечение
Поставить диагноз уровня вирулентности возбудителей заболевания (равно как и устойчивости растения-хозяина к действию инфекции) можно методами биохемилюминесценции. Сюда относятся явление сверхслабого свечения (ССС), а также длительного послесвечения (ДПС).
Сверхслабое свечение представляет собой спонтанное световое излучение живых клеток в видимой области спектра. Интенсивность этого свечения настолько низкая, что она не может быть оценена невооруженным глазом. Поэтому для регистрации ССС используют специальную аппаратуру из группы фотоумножителей. ССС связано с окислением некоторых соединений клетки, главным образом липидов и фенолов. Оно наблюдается только в присутствии кислорода. В механизме ССС участвуют активные формы кислорода (свободные радикалы кислорода, возбужденный кислород, перекисные соединения и др.).
Установлено, что повреждающее воздействие на живую клетку факторов самой различной природы вызывает «вспышку» — усиление ССС различной продолжительности (от нескольких секунд до нескольких часов). Вспышка сопровождается увеличением концентрации свободных радикалов и накоплением продуктов окисления липидов и фенолов. В любом случае этот эффект обусловлен нарушением состояния физиологических систем, защищающих клетку от побочного токсического действия кислорода. В результате происходит окисление мембранных липидов и другие патологические процессы, часть которых сопровождается свечением.
На примере ряда факторов (высокие и низкие температуры, обезвоживание и т. д.) Б. Н. Тарусов с сотрудниками показали корреляцию между величиной вспышки и силой нанесенного повреждения. Принципиально возможно использовать вспышку ССС как диагностический признак. Оказалось, что характер изменений ССС растений зависит от степени их устойчивости к определенному повреждающему воздействию. Поэтому хемилюминесцентный метод уже эффективно используют для оценки засухо-, морозоустойчивости сельскохозяйственных культур и устойчивости к другим неблагоприятным воздействиям.
Сотрудники кафедры физиологии растений МГУ совместно с кафедрой биофизики провели работы по регистрации ССС у растений хлопчатника различной степени устойчивости к вилту, а также оценку физиологической активности возбудителей этого заболевания. Они обнаружили, что корни проростков восприимчивых сортов хлопчатника, выдержанные 2 суток в суспензии конидий фузариум (или вертициллиум), отличались от контрольных (незараженных) корней по уровню ССС. Зараженные корни светились в день извлечения из суспензии, как правило, сильнее, чем контрольные. Это позволяет сделать вывод, что ССС, в принципе, может быть использовано как диагностический признак устойчивости хлопчатника. Вместе с тем, поскольку корни хлопчатника светятся очень слабо, различия между отдельными формами растений не всегда представляются достаточно надежными и достоверными, Это заставило нас разработать приемы повышения интенсивности ССС. Например, таким приемом может служить обработка корней концентрированным раствором сахарозы, ибо корни зараженных и контрольных растений весьма отчетливо отличаются по реакции ССС на изменения концентрации внешнего раствора.
Если концентрированный раствор сахарозы, в который помещены корни, заменить водой, то свечение усиливается. У зараженных растений на 7—12-й день свечение возрастало в меньшей степени и медленнее, чем у контрольных. Такие различия кинетики ССС наблюдались еще до того, как обнаруживались внешние признаки заболевания. Значит, ССС выявляет самые ранние этапы заражения тканей растения. Оно регистрируется и в тех случаях, когда растение успешно сопротивляется инфекции и выздоравливает. Был проведен опыт. Проростки устойчивого сорта 9155-И заразили конидиями фузариум. У зараженных корней свечение возрастало быстрее и в большей степени, чем у контрольных. Иными словами, соотношение было противоположным, чем в опытах с восприимчивыми сортами.
При измерении интенсивности свечения мицелия грибов фузариум и вертициллиум различной вирулентности оказалось, что патогенный штамм фузариума светился в 4 раза слабее, чем авирулентный. В то же время патогенный штамм вертициллиум в отличие от авирулентного практически не светился вовсе. Это дает основания предположить, что электронно-транспортная цепь авирулентных организмов функционирует менее эффективно. У них в ходе окисления субстратов дыхания происходят отклонения от нормального пути транспорта электронов, в результате чего часть реализуемой энергии теряется в виде квантов биохемилюминесценции. Все это подчеркивает функциональную зависимость вирулентности возбудителей фузариозного вилта от общей эффективности их энергообмена.
Итак, фитопатогенные агенты обладают сложным комплексом физиологически активных метаболитов. Они способны вызвать существенные и разносторонние нарушения нормального функционирования регуляторных механизмов в инфицируемых ими тканях зеленого растения. Что касается природы свойств, с которыми связаны уровни вирулентности и вредности возбудителей, то падежным ориентиром для суждения о них могут служить такие показатели энергообмена, как общая структура окислительного аппарата, состав ферментов и их изозимные спектры, природа переносчиков электронов, соотношение путей окисления и его энергетическая эффективность (коэффициенты P/О, АДФ/О). Эти показатели могут быть с успехом использованы в селекционной работе, при выведении сортов хлопчатника, устойчивых к патогенным, агрессивным штаммам возбудителей вилта.
Исследования в этой области имеют не только большое теоретическое значение, но и весьма важны в практическом отношении. В успешном их развитии заинтересованы прежде всего селекционеры.
В настоящее время общепризнанно, что наиболее надежный путь борьбы с болезнями растений состоит в выведении устойчивых (иммунных) сортов. В этих целях испытывают вновь создаваемые селекционером формы растений на уже упоминавшихся инфекционных (провокационных) фонах, т. е. на почве с определенным количеством инфекционного материала (культура гриба-возбудителя, выращенного в лабораторных условиях на той или иной среде, запахивание в почву больных растений и т. п.).
Особенно широко используют испытание на инфекционных фонах при селекции сельскохозяйственных культур на устойчивость к корневым болезням, либо заболеваниям, вызванным микроорганизмами, проникающими в растение через корни. Все эти приемы обладают, однако, существенными недостатками — они не позволяют контролировать количество вносимого в почву инфекционного материала и, что особенно важно, качественный (расовый) состав возбудителей. Широкие пределы варьирования уровней физиологической активности (вирулентность, патогенность) возбудителей заболеваний растений вилтом, различного типа корневыми гнилями и т. п. вызывают необходимость введения строгой объективной количественной и качественной оценки искусственных инфекционных полей. Именно этим целям и должны служить исследования, направленные на выяснение физиолого-биохимических основ патогенноности, вирулентности возбудителей болезней. Их результаты станут фундаментом подбора форм патогенов при формировании инфекционных фонов.