Факультет

Студентам

Посетителям

Реакция коагглютинации

Реакция коагглютинации (РКОА) — быстрый, удобный и технически простой метод выявления и типирования микроорганизмов, а также обнаружения их растворимых антигенов и токсинов.

РКОА с успехом применяется для диагностики сальмонеллеза, иерсиниозов, бруцеллеза, пастереллеза, сапа, мелиоидоза, вирусов.

Принцип реакции. Белок А (видоспецифический протеин) золотистого стафилококка обладает способностью соединяться с Fc-фрагментом IgG человека и ряда млекопитающих, в том числе лабораторных животных. При этом Fab-фрагменты антител остаются свободными и взаимодействуют с гомологичными антигенами.

Термин «коагглютинация» предложен Kronwall в работе, посвященной типированию пневмококков, подразумевая агглютинацию двух видов бактериальных клеток.

Основные преимущества РКОА: 1) высокая экономичность (в 50—250 раз дешевле других иммунологических методов); 2) довольно высокая чувствительность; 3) простота постановки (отсутствие необходимости в дорогом оборудовании для приготовления реагентов и учета реакций).

При подготовке и проведении РКОА можно выделить три основных этапа:

  • получение активной и стабильной по содержанию белка А взвеси золотистого стафилококка;
  • определение требований к иммунной сыворотке, используемой для сенсибилизации стафилококка, а также проведение процесса сенсибилизации;
  • постановка реакции и учет результатов.

Получение активной и стабильной по содержанию белка А взвеси золотистого стафилококка. Присутствие белка А является видовым признаком золотистого стафилококка, однако в качестве продуцента обычно используют S. aureus (штамм Cowan 1), наиболее богатый белком А. Приготовление из него реагента для коагглютинации заключается в предварительной обработке клеток, обеспечивающей закрепление на их поверхности белка А и предупреждающей потерю активности в процессе длительного хранения суспензии клеток.

Штамм Cowan 1 можно культивировать как на жидких, так и на плотных питательных средах.

Использование жидкой питательной среды. Суточную агаровую культуру штамма Cowan 1 засевают в жидкую пептонно-дрожжевую среду и выращивают в течение 12…14 ч при усиленной аэрации (встряхивание на шутгель-аппарате при 100 движениях в 1 мин). Это способствует накоплению белка А.

Пептонно-дрожжевую среду готовят по специальной прописи: пептон — 10 г, дрожжевой экстракт — 5 г, глюкоза — 2 г, двузамещенный фосфат калия — 3 г, дистиллированная вода — 1 л. Среду стерилизуют в течение 30 мин при 115 °С; pH после этого составляет 7,2…7,4. Посевная доза — смыв с одного скошенного агара на 2 л питательной среды.

Бактериальные клетки осаждают центрифугированием в течение 15 мин при частоте вращения 3000 мин-1 и дважды отмывают от питательной среды в ФБР (pH 7,2…7,4). Измеряют сырую массу бактерий и доводят до 10%-й концентрации с помощью ФБР. Взвесь отмытых микробов обезвреживают 0,5%-м раствором формалина в течение 2 ч.

Использование плотной питательной среды. В качестве плотной питательной среды можно использовать агар Хоттингера с содержанием аминного азота не менее 1,5 г/л или сердечно-мозговой агар. Посев производят с бульона Хоттингера. Чашки или матрасы засевают 18…20-часовой культурой и выращивают в течение 16…18 ч при 37 °С. После этого смывают ФБР (pH 7,2…7,4) и центрифугируют при частоте вращения 10 000 мин-1 в течение 15 мин. Затем над осад очную жидкость удаляют, а осадок тщательно ресуспензируют в 0,5%-м формалине с таким расчетом, чтобы получить 10%-ю взвесь. После этого приготовленная взвесь встряхивается в шуттель-аппарате при 100 колебаниях в 1 мин и 37 °С в течение 3 ч. Затем клетки стафилококка дважды отмывают от формалина ФБР (pH 7,2…7,4) центрифугированием при частоте вращения 10 000 мин-1 в течение 15 мин и выдерживают 30 мин при 80 °С на водяной бане. После этого осадок окончательно ресуспензируют в ФБР до получения 10%-й взвеси и консервируют мертиолатом натрия.

Вне зависимости от того, каким способом получают взвесь стафилококка, необходимо на каждом этапе контролировать биологическую активность белка А. Очень простой контроль — использование эритроцитарного диагностикума для обнаружения ревматоидного фактора (ЦРФ) (выпускается С.-Петербургским ИВС) по следующей методике. Ампулу с препаратом вскрывают и вносят туда 1 мл 0,85%-го раствора NaCl. Хорошо обезжиренное стекло делят на две равные части: на одну половину наносят каплю 0,85%-го физиологического раствора, а на другую — одну петлю культуры S. aureus Cowan 1. Затем добавляют по одной капле диагностикума и хорошо перемешивают. Учитывают реакцию через 3…5 мин. При достаточно высокой биологической активности протеина А эритроциты склеиваются: в капле хорошо выражена агглютинация. В отрицательном случае и в контроле — равномерная взвесь эритроцитов.

В жидком виде 10%-ю взвесь хранят не более 1,5…2 мес при 4…6 °С: при длительном сроке снижается активность белка А.

Санкт-Петербургским НИИЭМ им. Пастера выпускается коммерческий препарат — стафилококковый реагент, содержащий белок А сухой. Для приготовления соответствующих диагностикумов следует использовать лишь те серии препарата, которые не дают спонтанной агглютинации.

Требования к иммунной сыворотке, используемой для сенсибилизации клеток стафилококка, и проведение процесса сенсибилизации. Для получения коагглютинирующего реагента взвесь стафилококков следует обработать иммунной сывороткой против искомого антигена. Сыворотка должна быть взята от животного, IgG которого обладает сродством к белку А. Наибольшим сродством к нему обладают иммуноглобулины человека, свиньи, собаки и морской свинки, меньшим — осла и кролика, a IgG овцы, лошади, крысы и мыши взаимодействуют с ним очень слабо.

Помимо строгой специфичности к искомому антигену сыворотка, используемая в РКОА, не должна содержать антител к стафилококку, чтобы избежать агглютинации стафилококкового реагента, обусловленной специфическим воздействием антигена и антител, которая в системе IgG — белок А должна быть исключена. Контроль проводят путем смешивания на стекле одной капли сыворотки и 10%-й суспензии стафилококкового реагента. Если по истечении 3…5 мин не образуются хлопья агглютината, то сыворотку считают пригодной для реакции.

Если имеющиеся образцы сывороток к этому антигену агглютинируют стафилококк, то можно провести их адсорбцию взвесью стафилококковых клеток, не имеющих белка А (например, штаммы Wood-46). Таким путем удаляют антитела, реагирующие со стафилококком за счет Fab-фрагментов.

Адсорбцию проводят путем смешивания равных объемов сыворотки и 10%-й суспензии стафилококка штамма Wood-46. Смесь инкубируют в течение 30…40 мин при 20…25 °С, затем центрифугируют 20 мин при частоте вращения 3000 мин-1. Надосадочную жидкость используют для сенсибилизации стафилококкового реагента.

Таким образом, сыворотка, применяемая для приготовления коагглютинирующего реагента, должна отвечать следующим требованиям:

  • получена от животного-продуцента, IgG которого обладает сродством к белку А;
  • должна обладать специфичностью по отношению к искомому антигену;
  • быть свободна от противостафилококковых антител.

Выбор оптимального рабочего разведения антисыворотки. Оптимальное соотношение IgG сыворотки и протеина А на поверхности стафилококка имеет большое значение для чувствительности получаемого диагностикума: при избытке IgG может происходить спонтанная агглютинация клеток стафилококка, а при недостатке — снижение чувствительности диагностикума. Зоны оптимального соотношения между реагирующими агентами можно достичь путем предварительного определения разведения сыворотки, наиболее эффективного для приготовления диагностикума с максимальной чувствительностью.

Техника определения оптимального разведения сыворотки. 1. В пробирках готовят последовательные разведения специфической сыворотки 1:10…1:1280 в объеме 1 мл.

2. К каждому разведению добавляют по 1 мл 10%-й взвеси приготовленного стафилококкового реагента.

3. Смесь встряхивают на шуттель-аппарате при 90 колебаниях в 1 мин в течение 60 мин при 40…42 °С.

4. Клетки стафилококка дважды отмывают ФБР от избытка IgG и других компонентов сыворотки центрифугированием при частоте вращения 5000 мин-1 в течение 10 мин.

5. Осадок ресуспензируют до 2%-й концентрации ФБР (pH 7,2…7,4).

6. Полученные диагностикумы контролируют для исключения спонтанной агглютинации. С этой целью на предметное стекло наносят по одной капле каждого диагностикума, добавляют столько же физиологического раствора и учитывают результат.

Изменение гомогенности в сторону даже слабой агрегации указывает на спонтанную агглютинацию в этой пробе диагностикума, и соответствующее разведение расценивают как непригодное для дальнейшего получения диагностикума.

Из пробирок с диагностикумами, не давшими спонтанной агглютинации, наносят на предметное стекло по 3 капли и к каждой добавляют по 1 капле взвеси соответствующего возбудителя в количестве 100 млн м. т./мл, 500 млн, 1 млрд, 2 млрд, 3 млрд и 4 млрд м. т./мл. Капли смешивают и учитывают результат. За оптимальные рабочие разведения иммунной сыворотки принимают те диагностикумы, на основе которых происходила агглютинация с минимальными количествами микроорганизмов.

Определение оптимальных рабочих разведений иммунной сыворотки необходимо проводить каждый раз при использовании новой серии сыворотки.

Приготовление диагностикума. Приготовленный 10%-й стафилококковый реагент соединяют с равным объемом иммунной сыворотки в определенном ранее оптимальном рабочем разведении. Смесь встряхивают в течение 60 мин при 40…42 °С в шутгель-аппарате при 90 колебаниях в 1 мин. Затем через 15 мин дважды отмывают ФБР, ресуспензируют до 2%-й взвеси и консервируют мертиолатом натрия (1 : 10 000).

Постановка РКОА. Жидкий диагностикум необходимо тщательно встряхнуть. На предметное стекло помещают каплю Ко-диагностикума и с помощью бактериологической петли вносят часть исследуемой колонии, предварительно тщательно растерев ее в капле физиологического раствора рядом с каплей диагностикума, а затем смешивают с ней до получения гомогенной взвеси.

При наличии в исследуемой культуре искомого возбудителя через 1…3 мин наступает положительная реакция коагглютинации: просветление жидкости с образованием хлопьев. Учет результатов реакции следует проводить на темном фоне.

Учет результатов. Результаты оценивают по следующим показателям:

«++++» — все стафилококки агглютинированы и легко скатываются к краю капли при наклоне стекла, при этом остальная часть полностью просветлена;

«+++» — агглютинация большей части стафилококков, частичное просветление капли;

«++» — на фоне слабо просветленной взвеси четко виден агглютинат;

«+» — агглютинация слабо выражена; мелкие легкие хлопья (отрицательный результат);

«—» — взвесь гомогенна, сходна с отрицательным контролем.

За положительную учитывают реакцию не менее чем на «++».

Каждый опыт сопровождается постановкой нескольких отрицательных контролей: 1) стафилококковый реагент, сенсибилизированный нормальной сывороткой + испытуемый материал; 2) Ко-диагностикум + ФБР; 3) испытуемый материал + ФБР.

Преимуществом РКОА является и то, что обнаружение того или иного возбудителя можно проводить непосредственно в патологическом материале (кровь, секционный материал, фекалии). Во избежание неспецифических реакций следует провести адсорбцию суспензией стафилококка этого материала, который может содержать IgG. С этой целью смешивают равные объемы 10%-й взвеси стафилококкового реагента и испытуемого материала, в котором предполагается присутствие микроорганизма. Смесь выдерживают в течение 30 мин при 37 °С, два раза центрифугируют, а надосадочную жидкость используют для дальнейшего исследования. Кроме того, при работе с патологическим материалом необходимо добиться того, чтобы он не содержал взвешенных частиц (т. е. был прозрачен), так как это может послужить причиной ложноположительных результатов.

Техника постановки РКОА с надосадочными жидкостями, копрофильтратами и др. Каплю патологического материала смешивают с каплей Ко-диагностикума осторожным покачиванием стекла. Результат учитывают через 5…30 мин после выдержки стекол во влажной камере. Постановка контролей и техника учета результата аналогичны вышеописанным.

РКОА при соблюдении всех требований к иммунным сывороткам, а также оптимальных условий сенсибилизации довольно специфична: не более 1…2 % ложноположительных результатов.

Практическое применение. Необходимо отметить, что существуют и другие методики приготовления диагностикума для РКОА. Описанная методика апробирована для типирования и обнаружения в патологическом материале (фекалии, молоко) Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis. Чувствительность сконструированных диагностикумов составляла 5 ∙ 107…5 ∙ 108, что практически совпадало с чувствительностью коммерческих диагностикумов.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: