Факультет

Студентам

Посетителям

Реакция агглютинации латекса

Реакция агглютинации латекса (РАЛ), или реакция латекс-агглютинации, разработана давно, однако она не нашла достаточно широкого применения в медицине и в ветеринарии.

Тем не менее усиливающаяся тенденция использовать в качестве носителей антигенов и антител инертные синтетические материалы привела к оживлению интереса к РАЛ и широкому изучению возможностей ее применения.

Принцип метода. Механизм РАЛ аналогичен РИГА, в которой используют сенсибилизированные антигенами или антителами эритроциты человека или животных. Для постановки РАЛ применяют сенсибилизированные частицы полистирольного латекса, которые в присутствии гомологичного реагента склеиваются. Обычно эта реакция проходит очень быстро (3…8 мин), что позволяет применить ее в качестве экспресс-метода для выявления антигенов и антител.

Преимущества РАЛ в том, что частицы латекса в отличие от эритроцитов не имеют перекрестно реагирующих антигенов, поэтому она специфичнее РИГА.

Материалы и реагенты. 1. Суспензия латекса. Для приготовления диагностикумов обычно используют частицы латекса диаметром 0,81…1 мкм. При применении более крупных частиц диаметром 0,22…0,3 мкм затруднен учет реакции и технологический процесс получения диагностикумов резко усложняется, а частиц более 1 мкм хотя не влияет на активность латексных диагностикумов, но существенно увеличивает частоту неспецифических реакций.

Для постановки РАЛ лучше использовать очищенные латексы с гомогенными частицами правильной сферической формы. Густота суспензии латекса обычно составляет 1 %, но может достичь в отдельных случаях 1,3…1,4 %.

2. Буферные растворы. Для приготовления суспензии сенсибилизированных частиц латекса может быть использован изотонический раствор хлорида натрия, однако целесообразнее применять буферные растворы: трисовый (pH 7,2…8,2), трис-солянокислый (pH 7,2), глициновый (pH 8,2), гликолевый, боратно-солевой и др. В этом случае желательно проводить предварительную апробацию системы «латекс — буфер» в экспериментальных условиях и выбор оптимального варианта для практической работы. Иногда в процессе приготовления латексного диагностикума возникает необходимость в использовании нескольких различных буферных растворов.

3. Антитела. Для сенсибилизации частиц латекса пригодны гипериммунные сыворотки, полученные при иммунизации лабораторных животных (кроликов, крыс, мышей и др.). Повышению специфичности РАЛ и уменьшению числа ложноположительных и перекрестных реакций способствует применение очищенных иммуноглобулиновых фракций.

Методика исследования. Основные этапы постановки РАЛ. В настоящее время РАЛ обычно ставят на стеклянных или полистироловых пластинках, используя коммерческие диагностикумы или препараты. Реже применяют пластинки с лунками для постановки РИГА или пробирочный вариант реакции. Манипуляции выполняют в определенной последовательности.

1. Делают ряд серийных разведений исследуемого материала. Сыворотки крови необходимо предварительно прогреть в течение 30 мин при 56 °С или 20 мин при 60 °С. При постановке РАЛ на пластинках для РИГА при разведении материала используют петли микротитратора. На плоские ровные пластины наносят по одной капле соответствующих разведений.

2. Добавляют к каждому разведению равный объем суспензии сенсибилизированного латекса. Смешивают 1 каплю исследуемого материала и диагностикум, в лунки вносят по 15, 25 или 50 мкл ингредиентов реакции.

При постановке РАЛ в пробирочном варианте используют 0,25 мл исследуемого материала и 0,05 мл (или 0,1 мл) диагностикума.

3. Помещают пластинки на вращающийся столик или в шуттель-аппарат на 3…5 мин, после чего производят регистрацию результатов реакции.

Учет результатов. Независимо от вида диагностикума и количества антител (антигена) в исследуемом материале результаты РАЛ могут быть учтены уже через несколько минут после смешивания реагентов. При наличии в исследуемом образце искомого микроорганизма склеивающиеся частицы латекса образуют агглютинат, хорошо видимый невооруженным глазом. Можно использовать лупы с небольшим увеличением. При отрицательных результатах реакции суспензия латекса остается гомогенно-мутной, без глыбок агглютината и участков просветления. При малой или низкой активности диагностикума, а также невысокой концентрации антигена пластинки лучше инкубировать при 37 °С, что несколько ускоряет образование агглютината.

Результат реакции оценивают по трехбалльной системе:

«++++» — четкая агглютинация, крупные хлопья в прозрачной жидкости;

«++» — четкая видимая агглютинация диагностикума, однако фон полностью не просветляется;

«-» — жидкость остается гомогенно-мутной (отрицательная реакция).

Применять промежуточные оценки интенсивности реакции («+++», «+») нецелесообразно, так как они достаточно субъективны.

Ставят несколько контролей: 1) исходное разведение исследуемого материала + суспензия несенсибилизированного латекса (отрицательный контроль); 2) нормальная сыворотка, не содержащая антител + суспензия сенсибилизированного латекса (проверка специфичности диагностикума); 3) гомологичная иммунная сыворотка + суспензия сенсибилизированного латекса (проверка активности диагностикума).

При постановке РАЛ с антительными латексными диагностикумами в контрольных положительной и отрицательных реакциях используют соответствующий антигенсодержащий материал.

Техника приготовления диагностикумов. Сенсибилизация латекса антигенами. Для приготовления антигенного латексного диагностикума желательно иметь в распоряжении растворимые антигены. В этом случае хорошие результаты получают при использовании буферных растворов (например, глицинового или боратного с pH 8,2). В таком буфере готовят раствор антигена в концентрации 2,5…5,0 мг/мл к 1 объему суспензии латекса. Если раствор антигена приготовлен на изотоническом растворе натрия хлорида, то буфер добавляют к смеси латекс — антиген.

Сенсибилизацию проводят в течение 2 ч при 37 °С в термостате или (лучше) на водяной бане. По истечении этого времени сенсибилизированный латекс осаждают центрифугированием в течение 5…10 мин при частоте оборотов 2000…2500 мин-1 и ресуспензируют в этом же буферном растворе до получения 1%-й суспензии.

Сенсибилизация латекса антителами. Суспензию латекса смешивают с равным объемом иммунной сыворотки или очищенной гамма-глобулиновой фракции в соответствующем буферном растворе. Смесь инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре или при 37 °С, центрифугируют в течение 30 мин при частоте оборотов 3…5000 мин-1 и дважды промывают осадок 0,01 М трис-солянокислым буфером с добавлением 200 мг/л поливинилпирролидона. Сенсибилизированный латекс ресуспензируют в этом же буферном растворе с поливинилпирролидоном и 0,05 % азида натрия и хранят в холодильнике при 2…4 °С.

При выборе оптимальной дозировки антител для сенсибилизации латекса следует учитывать, что одна его частица диаметром 0,8 мкм может адсорбировать на своей поверхности до 7,5 ∙ 104 молекул гамма-глобулина.

Необходимо отметить, что во многом требуется предварительно эмпирическим путем подбирать оптимальные условия для получения высококачественного латексного диагностикума. Режим сенсибилизации зависит от сорта и размера частиц латекса, pH и вида буферных растворов и ряда других факторов.

Для уменьшения частоты ложноположительных результатов рекомендуется к готовой суспензии сенсибилизированных частиц латекса добавлять нормальную сыворотку того вида животного, который был использован для приготовления гипериммунной сыворотки.

Получение латексных диагностикумов с помощью белка А стафилококка. Применение для изготовления диагностикумов на основе частиц латекса, покрытых белком А стафилококка, позволяет использовать для сенсибилизации латекса любые иммунные сыворотки без какой-либо их предварительной обработки.

Раствор белка А (1 мг/мл) готовят на дистиллированной воде с добавлением 0,05 % азида натрия. Перед применением его разводят в 200 раз 0,1 М глициновым буфером (pH 8,2), содержащим 1 % хлорида натрия. Стандартную коммерческую суспензию латекса разводят в 15 раз изотоническим раствором хлорида натрия, смешивают с равным объемом разведенного раствора белка А, инкубируют при постоянном перемешивании в течение 2…4 ч при 20 °С, а затем 16…18 ч при 4 °С. Частицы латекса, покрытые белком А, осаждают центрифугированием при частоте вращения 6000 мин-1 в течение 30 мин и дважды промывают половинным объемом глицинового буфера с добавлением 0,02 % поливинилпирролидона. Полученную суспензию после добавления 0,05 % азида натрия можно хранить при 4 °С в течение 4 мес.

Иммунную сыворотку разводят до титра глициновым буфером и смешивают с равным объемом суспензии латекса, покрытого белком А. Инкубацию и промывку сенсибилизированного антителами латекса проводят по методике, описанной выше.

Эту же методику можно использовать и для сенсибилизации латекса гамма-глобулиновыми фракциями, выделенными из иммунных сывороток посредством их насыщения сульфатом аммония. В этом случае продолжительность сенсибилизации антителами частиц латекса, покрытых белком А, можно сократить до 2 ч, исключив длительный 2-й этап, проводимый при 4 °С. Приготовленный таким образом диагностический препарат в 4…16 раз активнее обычного антигельного латексного диагностикума.

Практическое использование. К сожалению, в практических ветеринарных лабораториях РАЛ практически не используют, несмотря на то что она по чувствительности и специфичности превосходит многие классические серологические методы.

В настоящее время имеются сообщения об успешном применении РАЛ для диагностики туляремии, бруцеллеза, ряда вирусных инфекций. При использовании данных диагностикумов чувствительность РАЛ на стекле составляет 106 м. т./мл, а при постановке в полистироловых пластинках — 1,8 ∙ 104 м. т./мл (бруцеллез) и 1,25 ∙ 105 м. т./мл (туляремия). Кроме того, разработаны латексные диагностикумы для выявления возбудителей иерсиниоза, псевдотуберкулеза, листериоза, сальмонеллеза. Имеются также сведения об успешных испытаниях специально разработанного для ветеринарии латексного антигенного диагностикума для выявления антител к возбудителю туберкулеза.

Безусловные преимущества РАЛ: 1) простота постановки; 2) отсутствие какого-либо специального оборудования; 3) достаточно высокие чувствительность и специфичность.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: