Факультет

Студентам

Посетителям

Перенос вирусов и микоплазмоподобных организмов с помощью векторов

Для обнаружения вирусов и изучения их свойств может возникнуть необходимость в переносе вирусов с помощью векторов.

Переносимость определенным вектором является важным диагностическим признаком. Исследования по диагностике с использованием этого свойства вирусов связаны с определенными предпосылками, указанными ниже.

Экспериментальные работы начинают со сбора переносчиков из природных популяций. Сбор должен ставить задачей получение живых и неповрежденных особей. Для этого пригодны различные методы.

Сравнительно трудоемким, но очень целесообразным для сбора определенных переносчиков, например цикад, является применение эксгаустера, с помощью которого засасывают и собирают отдельных насекомых. Мелких и легко повреждаемых насекомых (тли, галловые клещи) лучше всего собирать вместе с частями растений, на которых они находятся в естественных условиях. Почки, листья или побеги помещают в закрытые марлей стеклянные пробирки или пленочные пакеты и в лаборатории извлекают вредителей. Наконец, для этих же целей пригодны светоловушки, с помощью которых в сумерках и ночью можно отлавливать летающих насекомых. Свободноживущих нематод, используемых в качестве векторов, отмывают из почвенных проб, отбирая их в разных точках и с разной глубины данного участка. Для отмывки пригодна аппаратура, предложенная Остербринком.

Векторы, используемые в опытах по диагностике вирусов, должны отвечать определенным требованиям: быть свободными от вирусов, относиться к одному виду и полу, достичь одной стадии развития.

Некоторые требования предъявляются и к растениям, используемым для разведения переносчиков, они должны быть свободными от вирусов и пригодными для питания и откладки яиц. Чтобы гарантировать отсутствие вирусов в растениях, желательно выбирать виды, не заражаемые теми патогенами, для диагностики которых используются данные переносчики. Например, для разведения тлей пригодна китайская капуста (Brassica sinensis), не восприимчивая ко многим вирусам картофеля, зерновых, бобовых и плодовых культур.

Поскольку пригодность определенного вида растения для питания и откладки яиц не всегда совпадает, часто бывает необходимо использовать для разведения векторов несколько видов. Например, для цикадки Euscelis plebejus кормовым растением служат кормовые бобы (Vicia faba), а откладка яиц происходит на костре безостом (Bromus inermis). Кормовые растения следует выращивать и использовать в состоянии, при котором подопытные векторы всегда в достаточной мере обеспечены хорошим питанием.

При разведении векторов для каждого вида необходимо обеспечить условия, близкие к оптимальным. Так, для выращивания бескрылых тлей нужны хорошо вентилируемые помещения с молодыми растениями, которые растут при постоянном освещении и не слишком плотно заселены тлями. Очень разные требования к условиям среды предъявляют цикады. Для разведения тлей и цикад пригодны обтянутые марлей инсектарии с открывающейся передней стенкой. Размер их должен соответствовать высоте используемых в каждом случае кормовых растений. Для кратковременного содержания насекомых, например в течение времени, необходимого для передачи вируса, можно использовать растения в горшках, над которыми с помощью двух дуг натянута марля.

Нематод-переносчиков содержат во влажной (невысушенной, но и непереувлажненной) почве, по возможности в естественных условиях. Для этого пригодны бетонные кольца, углубленные в содержащую нематод почву примерно на 75 см. На участке высаживают кормовые растения для соответствующего вида нематод. Культуру фитопатогенных нематод можно поддерживать и в теплице, используя горшки с растениями, погруженные во влажный торф.

Грибы-переносчики лучше всего культивировать на корнях растений-хозяев. Их выращивают во влажном стерилизованном песке, из которого легко получить суспензию зооспор, в смеси песка с торфом или в стерилизованной почве.

Некоторые переносчики, например нематода Xiphinema diversicaudatum или цикадки, плохо выдерживают искусственное разведение. Для экспериментальных целей их лучше всего собирать с естественно инфицированных растений.

Для переноса вирусов используют различное число особей одного вида вектора, чем больше это число, тем выше вероятность переноса. Например, при работе с тлями на одно индикаторное растение нужно не менее 10 особей.

Чтобы воспрепятствовать миграции векторов, особенно цикадок, во время эксперимента, испытываемые или индикаторные растения следует помещать в изоляторы или обтянуть марлей. Тлей и галловых клещей можно пересаживать прямо с кусочками листьев растений, зараженных вирусами.

Перенос вирусов тлями. В опытах по переносу вирусов с помощью тлей следует учитывать, что по длительности периода персистентности, т. е. времени сохранения тлями инфекционности после прекращения питания на источнике инфекции, вирусы делятся на три группы:

1) неперсистентные вирусы, которые сохраняют инфекционность в переносчике или на его поверхности лишь несколько часов (как правило, менее часа); время, необходимое для поглощения вируса переносчиком или его передачи, составляет часто только несколько секунд или минут;

2) полуперсистентные вирусы, которые сохраняются в переносчике от 10 до 100 ч, однако в определенных случаях их трудно дифференцировать от двух других групп;

3) персистентные вирусы, которые сохраняются в переносчике более 100 ч, часто даже в течение всей его жизни; для поглощения этих вирусов требуется, как правило, от 10 минут до часа. Часто за поглощением следует латентный период длительностью от 12 ч и более, в течение которого вирус в переносчике не обнаруживается и не может быть им передан.

К числу неперсистентных вирусов, переносимых тлями, относятся, в частности, Y-вирус картофеля, вирусы желтой мозаики фасоли и огуречной мозаики. Из полуперсистентных вирусов экономически наиболее важным является вирус некротической желтухи свеклы. Среди персистентных вирусов большое значение имеют вирусы скручивания листьев картофеля, слабого пожелтения свеклы и желтой карликовости ячменя.

Важнейший из тлей-переносчиков вид — Myzus persicae, а также Aphis fabae, Aulacorthum solani и Macrosiphum euphorbiae переносят большое число вредоносных вирусов.

Тлей осторожно пересаживают поодиночке с заселенного ими растения на другие растения для поглощения или передачи вирусов, используя для этого увлажненную тонкую акварельную кисточку. Предварительно насекомых следует потревожить, чтобы они извлекли стилеты из тканей растений и пересадка прошла без повреждений.

Часто пересаженные переносчики покидают индикаторные растения, так как они не подходят в качестве хозяев. Чтобы воспрепятствовать этой миграции, тлей фиксируют на листьях с помощью микрокамер — стеклянных или пластиковых колечек, верхняя сторона которых закрывается марлей, а нижняя с помощью магнитной резины прикрепляется к поверхности листа. Такие камеры можно применять на отдельных листьях или целых растениях для инфицирования переносчиков.

Перенос вирусов цикадками. Вирусы, переносимые цикадками, с трудом или вообще не передаются механическим путем. Эти насекомые питаются соком флоэмы и накапливают концентрирующиеся в ней вирусы, для их поглощения и передачи требуется по меньшей мере несколько минут. Перенос цикадками большинства вирусов сходен с переносом персистентных вирусов тлями. Цикадки передают вирус еуровой карликовости кукурузы и карликовость клевера, предположительно вызываемую МПО. К важным переносчикам относятся, в частности, виды Aphrodes bicinctus, Euscelis plebejus, Macrosteles laevis.

Для пересадки цикадок у стеклянной стенки инсектария устанавливают лампу: вследствие положительного фототаксиса насекомые собираются на стекле против лампы и их легко собрать с помощью эксгаустера. Для пересадки отдельных особей или точного их определения насекомых необходимо предварительно обездвижить с помощью углекислого газа.

Перенос вирусов клещами. Вирусы, переносимые клещами, передаются механическим путем или только прививкой. При сосании клещи прокалывают немногие слои клеток, а иногда проникают лишь в эпидермис. Галловые клещи, в частности виды Aceria tulipae и Cecidophyopsis ribis, являются переносчиками вирусов полосчатой мозаики райграса и реверсии (махровости) черной смородины. Пересадку отдельных особей проводят только под стереомикроскопом при 20—30-кратном увеличении, используя для этого какой-нибудь волосок, укрепленный в держателе. Пересаживать можно только подвижных клещей, так как у питающихся повреждаются ротовые органы. Иногда клещей пересаживают с кусочками листьев.

Перенос вирусов нематодами. У вирусов, переносимых нематодами, наблюдается выраженная специфичность по отношению к переносчикам: неповирусы переносятся нематодами родов Xiphinema или Longidorus, тобравирусы — видами Trichodorus. Ротовые части вирофорных нематод и тлей очень сходны. Для поглощения непо — и тобравирусов при питании на зараженном растении и для передачи патогенов другому растению нематодам требуется от 15 минут до 1 часа. Сравнительно часто встречающиеся и переносимые нематодами вирусы — это возбудители мозаики резухи, черной кольцевой пятнистости томата и погремковости табака. К широко распространенным вирофорным видам нематод относятся Xiphinema diversicaudatum, Longidorus elongatus и Trichodorus primitiims.

Нематод отмывают из почвенной пробы и вносят в горшки с растениями, зараженными вирусами. Через 4—8 недель нематод вновь отмывают и переносят под индикаторные растения, еще через 4—8 недель корни индикаторов путем механической инокуляции исследуют на заражение вирусами, так как на надземных органах симптомы в большинстве случаев отсутствуют.

Перенос вирусов грибами. Механизм переноса вирусов грибами может быть различным. Некоторые вирусы, например возбудитель некроза табака, адсорбируются на поверхности зооспор Olpidium brassicae, при втягивании жгутика попадают в протоплазму зооспор и затем в клетки корня растения-хозяина. В покоящихся спорах гриба вирус некроза табака не содержится. Наоборот, возбудитель разрастания жилок находится в самом переносчике и сохраняется в его покоящихся спорах. Передача вирусов, переносимых грибами, может происходить и механически.

Кроме названных выше, грибами переносятся вирусы метельчатости верхушки картофеля и желтой мозаики ячменя. Переносчиками являются также виды Polymyxa graminis и Spongospora шЫеггапеа.

Используя перенос вирусов грибами, нельзя работать с отдельными организмами. Чтобы получить суспензию зооспор, зараженные грибами корни растений выдерживают 1—2 дня при несколько более низкой, чем обычно, влажности, стимулируя таким образом высвобождение зооспор. Затем корни погружают на 15—30 мин в воду, суспензию зооспор концентрируют центрифугированием и используют для передачи вирусов.

Перенос вирусов повиликой. Перенос повиликой (виды Cuscuta) можно использовать в тех случаях, когда прививка не удается из-за систематической отдаленности партнеров. Повилика паразитирует на вегетирующих растениях, поглощая из них питательные вещества с помощью гаусторий.

Если стебли повилики связывают два или более растений, то образуются «мосты», через которые могут транспортироваться вирусы.

Поскольку виды повилики обладают различной способностью к переносу, их можно применять для дифференциации смесей вирусов.

Для успешного проведения опытов с переносом вирусов повиликой ее образцы должны быть свободны от латентного вируса мозаики повилики, передаваемого семенами.

Семена повилики раскладывают на влажной фильтровальной бумаге и после прорастания помещают в пазухи листьев растений-хозяев, чтобы ускорить контакт проростков с ними. В дальнейшем от развивающихся нитей отрезают кусочки длиной 5—6 см и обвивают ими стебли или черешки листьев других растений.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: