Растяжение клеток — это второй процесс клеточной деятельности, важный для возникновения формы органа и габитуса всего растения.
Если размножение клеток создает основу для приобретения развивающимся органом той или иной формы, то при растяжении клеток осуществляется окончательное становление формы, а в некоторых случаях она может основательно измениться. Следует отметить, что растяжение клеток как закономерный физиологический процесс присуще только растениям и не наблюдается у других групп живых организмов в отличие от размножения клеток, которое является основой существования всех живых организмов.
Действие фитогормонов и в особенности ауксина на растяжение более изучено, чем на размножение и дифференциацию. Это связано с тем, что изучение действия ауксина на растяжение имеет более долгую историю, и, кроме того, для изучения растяжения клеток были найдены очень удобные объекты — отрезки колеоптилей злаковых и стеблей двудольных растений. Поэтому в настоящее время эта область исследований является наиболее продвинутой по сравнению с другими.
При сравнении роста клеток в зоне растяжения целого растения и отрезков этой зоны было найдено одно принципиальное отличие. Растяжение клеток в целом растении за исключением, может быть, последних его этапов сопровождается накоплением нуклеиновых кислот и белка. Рост отрезков, напротив, не сопровождается накоплением этих веществ. Поэтому был сделан вывод, что растяжение клеток и накопление белка могут идти одновременно, но между ними нет причинной связи.
Однако этот вывод, по-видимому, нельзя абсолютизировать. Сопоставление динамики растяжения клеток, сопровождающегося накоплением белка, т. е. в целом растении, и в отрезках показывает, что в первом случае рост происходит экспоненциально, а во втором при благоприятных условиях лишь линейно во времени. В наших опытах с культурой ткани табака растяжение клеток, вызванное пересевом ткани на среду без ауксина, сопровождалось увеличением количества белка в клетках и шло экспоненциально во времени.
Это различие в динамике позволяет предположить, что у отрезков «рабочий механизм» растяжения не увеличивается в процессе их роста и способен за равные промежутки времени обеспечивать прирост лишь на одну и ту же величину; у растягивающихся клеток в составе целого растения «рабочий механизм» растяжения увеличивается в процессе роста клеток. Так как «рабочим механизмом» у живых клеток являются ферментные системы, то различия в динамике роста и накоплении белка и нуклеиновых кислот между растяжением в целом растении и в отрезке растягивающихся клеток логично связываются между собой. Все это позволяет предположить, что накопление белка и скорость растяжения клеток не только сопровождают друг друга, но и связаны между собой.
Однако растяжение клеток относительно менее чувствительно к действию факторов, нарушающих синтез нуклеиновых кислот и белка, чем размножение. В опытах Иванова растяжение клеток и переход меристематических клеток к растяжению в кончиках корней кукурузы не прекращались после рентгеновского облучения в дозах, полностью подавляющих размножение клеток, или при обработке их хлорамфениколом в дозах, подавляющих размножение клеток. Растяжение клеток в целом растении и в отрезках не подавлялось 5-фторурацилом, тогда как в примененных дозах размножение клеток полностью прекращалось.
В наших опытах с культурой ткани табака растяжение клеток на среде без ауксина было значительно менее чувствительно к действию 8-азагуанина, чем размножение клеток на среде с ауксином. При этом было показано, что аналог действует на ткань специфически, так как его угнетающее действие снималось гуанином. Значительно менее чувствительно растяжение клеток и к гидразиду маленновой кислоты.
В работе с паренхимой стебля табака было показано, что растяжение клеток, вызванное введением в среду только ИУК, в 1000 раз менее чувствительно к действию изопропил-N-фенилкарбаматов, чем размножение клеток, происходящее на среде с ИУК и кинетином. Следовательно, даже в тех случаях, когда растяжение клеток сопровождается синтезом белка и нуклеиновых кислот, связь между ними не является такой тесной и напряженной, как в случае размножения клеток.
Поэтому многочисленные данные о том, что действие ИУК и других фитогормонов на растяжение клеток снимается или подавляется различными ингибиторами синтеза белка и нуклеиновых кислот, требуют внимательного рассмотрения и осторожного истолкования. Так, многочисленные эксперименты последних лег показывают, что эти ингибиторы прекращают реакцию отрезков колеоптилей и мезокотилей кукурузы, гипокотилей сои, эпикотилей гороха, кусочков клубней топинамбура на ауксин.
Однако эти данные еще не означают, что стимуляция растяжения клеток ауксином связана с его влиянием на синтез белка и нуклеиновых кислот. Помимо того, что специфический характер действия этих ингибиторов на растения не всегда доказывается, следует обратить внимание на то, что угнетающее действие этих ингибиторов обнаруживается не раньше, чем через 1,5—2 часа после их применения совместно с ауксинами. Ранее уже шла речь о том, что новый более высокий уровень скорости роста, интенсивности дыхания, пластичности клеточных стенок устанавливается уже через 15—30 минут. Отсюда следует, что, несмотря на присутствие ингибиторов, подавляющих синтез белка и нуклеиновых кислот, способность ткани реагировать на ауксин сохраняется по крайней мере 1,5 часа.
Эванс и Хокансон, обсуждая данные по влиянию удаления ауксина из среды на скорость роста отрезков колеоптилей кукурузы, говорят о том, что быстрое исчезновение стимулирующего действия ауксина трудно совместить с предположением о его первичном действии на синтез ферментов. Действительно, стимулирующее действие ауксина начинает уменьшаться сразу же после удаления его из среды и исчезает через 20—30 минут полностью, тогда как период полураспада ферментов в растениях значительно длиннее (2—4 и более часов).
Можно сделать вывод, что постоянный синтез белка и нуклеиновых кислот нужен скорее для сохранения тканью в течение длительного времени способности реагировать на ауксин, но этот синтез не является тем звеном во внутриклеточном метаболизме, на которое направлено действие ауксина, когда он стимулирует растяжение клеток.
При обработке ауксином зон роста целых растений в большинстве случаев наблюдается не столько ускорение их роста в длину, сколько их утолщение, т. е. вместо полярного растяжения клеток происходит их изодиаметрическое растяжение. Не вдаваясь пока в причины различного действия ауксина на рост отрезков и растяжение клеток в целом растении, следует обратить внимание на то, что в последнем случае действие ауксина сопровождается усилением накопления белка и нуклеиновых кислот, в особенности РНК. В наших опытах при опрыскивании зеленых проростков низкорослого гороха раствором ИУК уже через сутки наблюдалось значительное изодиаметрическое увеличение клеток коровой паренхимы, которое сопровождалось увеличением содержания белка и РНК в расчете на одну клетку и на одно междоузлие.
Интересно, что влияние ауксина на изодиаметрическое растяжение клеток корня снималось при концентрации хлорамфеникола, в которой он специфически угнетает синтез белка. Таким образом, действие ауксина на латеральное растяжение клеток в целом растении связано с синтезом белков и нуклеиновых кислот значительно теснее, чем его влияние на удлинение клеток изолированных зон растяжения. Следует отметить, что индукция латерального растяжения клеток другими агентами (цитокининами, колхицином) также сопровождалась накоплением белка и нуклеиновых кислот. Весьма интересны в этом отношении данные группы исследователей под руководством Маклахлана. Они показали, что когда ИУК наносили на поверхность среза декапитированных проростков гороха, то это вызывало значительное утолщение нижележащей зоны стебля, увеличение количества белка в ней и увеличение активности ферментов, связанных с метаболизмом клеточной стенки. Если вместе с ИУК наносили актиномицин D, то вместо индукции латерального утолщения ИУК в этом случае усиливала растяжение клеток в продольном направлении в такой степени, что оно было равно растяжению клеток растения с неудаленной верхушкой. Это действие ИУК не сопровождалось увеличением синтеза белка и ферментативной активности.
Таким образом, приведенные данные показывают, что существуют глубокие различия в действии ИУК на латеральное и на продольное растяжение клеток. В первом случае это действие связано с активацией синтеза белка.
Важное значение в стимуляции растяжения клеток отрезков придается действию ауксина на поглощение воды и клеточные стенки. В первых работах, посвященных этому вопросу, Хейн показал, что декапитация колеоптилей уменьшает пластическую (необратимую) растяжимость клеточных стенок под влиянием подвешенного груза, которая вновь увеличивается после добавления ауксина. На этом основании Хейн заключил, что ауксин увеличивает пластичность клеточных стенок и при наличии тургорного давления приводит к усилению поглощения воды и растяжения колеоптилей.
В дальнейшем постулировалось, что растяжение клеточных стенок — это пластическое их растяжение под влиянием давления воды на клеточные стенки, возникающего вследствие разности осмотического давления клеточного сока и наружного раствора. Роль ауксина сводилась при этом к размягчению клеточных стенок и уменьшению их резистентности к тургорному давлению.
При этом одни исследователи отводили ауксину роль фактора, способствующего удалению кальция из клеточных стенок, усилению метилирования свободных карбоксильных групп пектина и ослаблению вследствие этого поперечных связей между соседними полигалактуроновыми цепями пектина. Другие считали, что ауксин увеличивает активность ферментов разрушения клеточных стенок, глюканазы и целлулазы.
Все эти гипотезы можно объединить тем, что их авторы отводят поглощению воды во время растяжения клеток активную роль, а растяжению клеточных оболочек — пассивную. Однако накапливается все больше данных о том, что растяжение клеточных стенок включает в себя и активную компоненту, т. е. рост клеточных стенок.
Наши опыты показали, что при помещении отрезков колеоптилей кукурузы в раствор 2% сахарозы после предварительной инкубации их в течение 1,5 часов в воде обнаруживается начальная задержка роста, а при предварительной инкубации в растворе сахарозы этой задержки роста не наблюдается. При помещении отрезков после инкубации в воде в более концентрированные растворы (6%-ная сахароза, 0,4 М маннит) обнаруживается не только задержка роста, но и отдача воды в наружную среду (уменьшение веса колеоптилей). Эти данные позволяют предположить, что в 2%-ном растворе сахарозы задержка роста обусловлена установлением равновесия между осмотическим давлением клеточного сока и наружного раствора, и что поглощение воды отрезками зависит от разности осмотического давления внутреннего содержимого клетки и наружного раствора.
В другой серии опытов отрезки колеоптилей длиной 10 мм инкубировали в воде 1,5 часа, а затем переносили в 2%-ный раствор сахарозы с метиловым эфиром ИУК (5 мг/л) или без него. Через 0, 60, 180 и 360 минут длину отрезков измеряли с помощью горизонтального микроскопа и плазмолизировали 1 час в 1 М растворе маннита. После плазмолиза вновь измеряли длину отрезков. Эластичность определяли как убыль длины отрезков после плазмолиза. Пластичный прирост (необратимый определяли как увеличение длины плазмолизированных отрезков, а общий прирост — как увеличение длины неплазмолизированных отрезков.
При таком разделении общего прироста отрезков колеоптилей на обратимый и необратимый было найдено, что хотя при перенесении отрезков в 2%-ный раствор сахарозы общий и обратимый рост вначале не обнаруживался, необратимый пластический рост не прекращался и шел с постоянной скоростью в течение всех 6 часов опыта. Это свидетельствует о том, что пластическое растяжение клеточной оболочки может идти и тогда, когда поглощение воды не происходит. Об этом же говорит и наблюдавшийся нами факт медленного роста отрезков колеоптилей в 0,4 М растворе маннита. Однако скорость роста при этом была очень низкой, что говорит о необходимости нормального тургорного давления для роста клеточных оболочек.
Очевидно, гипотеза о влиянии ауксина на растяжение клеток должна как-то объединить факты, говорящие о размягчении клеточных стенок под влиянием ауксина, которое сохранялось и у мертвых препаратов клеточных стенок, с фактами ускорения роста оболочки под влиянием обработки ауксином.
Можно предположить, что во время растяжения полюса клеток растягиваются пассивно под влиянием тургорного давления. Но напряжение в оболочке, возникшее вследствие растяжения, снимается идущим одновременно процессом синтеза веществ оболочки, фиксирующим новую длину клетки и позволяющим оболочке вновь растянуться на некоторую длину. Поэтому роль ауксина, вероятно, сводится к стимулированию обоих процессов за счет активации ферментов синтеза и разрушения веществ оболочки. Вероятно, в некоторых случаях эти два процесса можно разобщить, например, с помощью гипертонических растворов маннита или других веществ.
Вернемся теперь к вопросу о латеральном растяжении клеток под влиянием ауксина. Следует отметить, что оно наблюдается в основном при обработке двудольных растений, в частности бобовых. Вероятно, при поступлении в растягивающиеся клетки целого растения экзогенный ауксин усиливает размягчение клеточных стенок и их рост не только у полюсов клеток, но и на тангентальных и радиальных сторонах.
В этой связи можно упомянуть, что вещества, тормозящие транспорт ауксина (трийодбензойная кислота, кинетин, этилен), также вызывают утолщение стеблей. Таким образом, можно предполагать, что при полярном транспорте ауксин проходит через полюса клеток и вызывает там соответствующие изменения в клеточных оболочках, а в тех случаях, когда транспорт нарушен или когда снабжение ткани ауксином превышает возможности системы полярного транспорта, ауксин может проходить через боковые стенки клеток и вызывать их размягчение и рост.
Хорошо известно, что гиббереллин усиливает растяжение клеток преимущественно в продольном направлении. Вопрос о том, не связано ли действие гиббереллина на растяжение клеток целого растения с увеличением количества ауксина, вызванным обработкой гиббереллином, с каждым годом получает все более и более определенное решение. Большинство данных говорит о том, что количество ауксина в тканях под влиянием гиббереллина увеличивается. Другая группа данных, полученных на отрезках органов, свидетельствует в пользу того, что для проявления стимулирующего действия гиббереллина на их рост необходим ауксин.
Следует отметить, что к результатам, полученным при использовании для определения количества ауксина биопробы на прямой рост отрезков колеоптилей, следует относиться с осторожностью, так как показано, что гиббереллин может стимулировать рост этих отрезков. При экстрагировании тканей, обработанных гиббереллином, он может оказаться в экстракте и исказить результаты биопробы на ауксин.
В наших опытах мы использовали для определения ауксина отрезки колеоптилей пшеницы, которые обнаруживали реакцию и на гиббереллин. Поэтому зоны хроматограмм экстрактов из проростков гороха мы испытывали на стимуляцию роста с помощью двух биопроб — отрезков колеоптилей пшеницы, дающих реакцию на ауксин и гиббереллин, и отрезков проростков кукурузы в зоне узла, которые реагировали только на гиббереллин. Если на гистограммах обнаруживались зоны, в которых наблюдалась стимуляция роста только отрезков колеоптилей, то лишь в этих случаях мы считали, что нам удалось определить активность, принадлежащую эндогенному ауксину. Под влиянием обработки проростков гороха гиббереллином обнаруживалось несомненное увеличение ауксиноподобной активности в экстрактах из стеблей, не связанное с присутствием гиббереллина в зонах, обладающих этой активностью. При этом почти вся гиббереллиноподобная активность обнаруживалась в экстрактах из листьев.
Таким образом, полученные нами данные оказались дополнительным свидетельством тому, что под влиянием обработки гиббереллином в тканях увеличивается количество эндогенных ауксинов.
Все гипотезы, связывающие действие гиббереллина с увеличением количества ауксина в обработанных тканях, сталкиваются с одним противоречием: добавление ауксина извне не вызывает такого же эффекта, как гиббереллин, и часто даже тормозят реакцию на гиббереллин. Вероятно, действие гиббереллина состоит не просто в увеличении количества ауксина, но в увеличении его в форме, активной в стимуляции растяжения клеток. В этой связи следует упомянуть, что в ряде работ отмечалось усиление полярного транспорта ауксина под влиянием обработки растений гиббереллином. Выше мы приводили данные о том, что активной в стимуляции растяжения клеток (формой ауксина следует считать транспортную форму. Видимо поэтому введение экзогенного ауксина без увеличения емкости системы полярного транспорта не способно усилить рост стебля целого растения в такой же степени, как это достигается с помощью гиббереллина. Но действие экзогенного ауксина сказывается в латеральном растяжении клеток обработанных тканей.
Вероятно, помимо влияния гиббереллина, связанного с увеличением количества активного эндогенного ауксина, существует и более слабое, самостоятельное, независимое от ауксина действие гиббереллина. Это предположение основано на наблюдениях, показавших аддитивность действия гиббереллина и ауксина на рост отрезков гороха, кукурузы, подсолнечника. В наших опытах с культурой ткани табака мы наблюдали, что гиббереллин стимулировал растяжение клеток на среде без ауксина, на среде с ауксином угнетал рост ткани, либо не действовал. Так как ауксин у этой ткани был фактором, необходимым для размножения клеток, а растяжение достигалось удалением из среды ауксина, то действие гиббереллина в этом случае также можно считать независимым от ауксина.
Примером независимого от ауксина влияния гиббереллина может служить индукция амилазной активности в эндосперме ячменя. Возможно, что самостоятельное действие гиббереллина на рост связано именно с такого рода влиянием на углеводный обмен.
Другой особенностью действия гиббереллина на растяжение клеток является обнаруженная недавно необходимость синтеза ДНК и чувствительность этого действия к ингибитору синтеза ДНК — 5-фтордезоксиуридину. Однако для каких-либо гипотез данных еще недостаточно.
Как ауксин и гиббереллин влияют не только на растяжение клеток, но и на их деление, так и цитокинин не только стимулирует деление клеток, но в некоторых случаях и их растяжение. Кинетин стимулировал рост отрезков колеоптилей кукурузы и пшеницы, но в большинстве случаев под влиянием кинетина и других цитокининов наблюдалась утолщение обработанных органов и угнетение их роста в длину. Возможно, это связано с угнетением полярного транспорта под влиянием кинетина. Во всех случаях обработка кинетином приводила к увеличению содержания белка и нуклеиновых кислот в тканях по сравнению с контролем.
Действие кинетина на растяжение клеток, так же как и гиббереллина, изучено еще слишком мало, особенно по сравнению с ауксином. Не известны еще многие параметры реакции: динамика действия, зависимость от концентрации, от продолжительности обработки, взаимодействие с другими химическими и физическими факторами. Но тот факт, что и эти фитогормоны оказывают влияние на растяжение клеток, позволяет предположить, что они играют определенную роль в регулировании растяжения клеток во время морфогенеза.
В зонах роста растений деление клеток в меристеме и рост клеток в зоне растяжения не происходят независимо друг от друга. Причем взаимозависимость между ними состоит не только в том, что меристема поставляет клетки в зону растяжения, но и в том, что она является источником ауксина для зоны растяжения, скорость роста которой зависит от способности меристемы образовывать и транспортировать ауксин. Арнеу и Манчинелли считают, что гиббереллин непосредственно влияет только на деление клеток в меристеме, а повышение митотической активности приводит к выработке дополнительных количеств ауксина. Согласно этим взглядам, ауксин вырабатывается и транспортируется не меристемой как таковой, а лишь активно функционирующей меристемой.
Следует обратить внимание на то, что факторы, нарушающие упорядоченность делений в тканях, вызывают нарушение и нормального направления растяжения клеток (ауксин, кинетин). Гиббереллин оказывал противоположное действие. Это позволяет предположить, что механизм регуляции направленности процесса в случае размножения и в случае растяжения клеток один и тот же — полярный транспорт ауксина. Очевидно, в растении этот механизм управляется с помощью эндогенных фитогормонов, которые позволяют создать в разных участках тела растения разные соотношения между полярно транспортируемым и нетранспортируемым ауксином и, следовательно, разные соотношения между ростом в длину и в толщину.