Это наиболее сложные по составу биопрепараты.
Для получения их обычно используют эпизоотические вирулентные вирусы. Их подвергают щадящей обработке (инактивации), которая приводит к необратимой утрате способности вируса размножаться (репродуцироваться), но при этом сохраняются его антигенные и иммуногенные свойства. Следовательно, в инактивированной вакцине должен быть «убит» вирусный геном (нуклеиновая кислота) и не должны подвергаться изменениям белки, гликопротеины, полисахариды вируса, так как иммунный ответ обусловлен главным образом веществами поверхности капсида вируса. В результате вирус утрачивает способность к репродукции и инфицированию, но сохраняет способность стимулировать у животных специфические факторы иммунитета.
Изготовление инактивированных вакцин также начинается с выбора производственного штамма вируса (с учетом основных его биологических свойств), культивирования и накопления производственного штамма вируса в чувствительной биологической системе (животные, эмбрионы птиц, культура клеток). Затем вируссодержащий материал подвергают очистке и концентрированию различными методами (низкоскоростное центрифугирование, фильтрование, ультрацентрифугирование и др.). Очистка и концентрирование вирусных агентов — важный этап, так как «убитый вирус» не размножается в организме, и для получения достаточно интенсивного иммунного ответа необходимо вводить значительное количество вирусного материала. Суспензии вируса должны быть очищены от балластных веществ (фрагментов клеточных структур, невирусных белков, липидов и др.), которые дают дополнительную нагрузку на иммунную систему организма и значительно снижают специфичность и напряженность иммунных реакций. Полученная после очистки и концентрации вируссодержащая суспензия подвергается инактивации. В случае особо опасных вирусов инактивация предшествует процессу очистки. При этом необходимо иметь в виду, что балластные вещества препятствуют процессу инактивации.
Важным условием эффективности вакцин является выбор инактиватора и оптимальных условий инактивации, позволяющих полностью лишить вирус инфекционности при максимальном сохранении антигенности. Однако механизм инактивирующих воздействий недостаточно изучен и их использование зачастую эмпирическое.
Для инактивации вирусов используют физические и химические методы. Из физических методов наиболее распространенными являются γ-лучи, УФ-лучи, воздействие температуры, реже ультразвука, фотодинамическое воздействие некоторых красителей (метиленовая синька, акридиновый оранжевый, толуидин и др.). Наиболее уязвимыми мишенями для γ-лучей являются пуриновые и пиримидиновые основания. Белковая оболочка под воздействием радиации повреждается незначительно. Этот метод дает возможность одновременно надежно инактивировать и стерилизовать готовый препарат.
Эффективность УФ-лучей определяется их проницаемостью и адсорбцией биологическими молекулами. Белки поглощают УФ-лучи в меньшей степени, чем нуклеиновые кислоты и поэтому более устойчивы к их действию. Полагают, что под влиянием УФ-лучей в нуклеиновой кислоте образуются димеры между соседними пирамидиновыми основаниями, а также ковалентные связи между нуклеиновой кислотой и белковой оболочкой.
В практике создания инактивированных вакцин наиболее широкое применение получили химические инактиваторы, такие, как формальдегид (присоединение формальдегида к аминогруппам пуринов и пиримидинов уничтожает матричную и информационную активность нуклеиновых кислот), β-пропиолактон, этиленимины, гидроксиламин (инактивирующее действие определяется его взаимодействием с пиримидиновыми основаниями нуклеиновой кислоты, зависящим от величины pH) и др. Реагенты, которые используют для инактивации вирусов, являются мутагенами, поэтому инактиватор должен либо подвергнуться самораспаду β-пропиолактон, гидроксиламин), либо переведен в неактивную форму (нейтрализован), а продукты нейтрализации — остаться безопасными.
После инактивации осуществляют контроль на авирулентность, направленный на выявление оставшихся жизнеспособных вирионов. Степень безопасности инактивированных вакцин неразрывно связана с чувствительностью тест-системы, по которой оценивается полнота инактивации вируса. Для этой цели используют чувствительные культуры клеток животных, в том числе эмбрионов птиц. При этом репродукции вируса быть не должно.
Индивидуальный подход определяется свойствами вируса, особенностями болезни, чувствительностью биологических систем. Так, авирулентность вакцин против ящура определяют на крупном рогатом скоте (это более надежно), на свиньях, лабораторных животных и культуре клеток; вакцину против бешенства — на белых мышах; вакцину против болезни Ауески — на кроликах или в культуре клеток, которую использовали для накопления вируса; вакцину против болезни Ньюкасла — на куриных эмбрионах (не менее трех слепых пассажей). Если производственный штамм вируса, который используют для получения вакцины, культивируется в культуре клеток и вызывает характерные цитопатические изменения, то общепризнанным методом является испытание инактивированных препаратов в чувствительных культурах клеток (не менее трех слепых пассажей). Однако при оценке безопасности некоторых вакцин используют сложные комплексные подходы.
Для повышения иммуногенной активности вакцины в ее состав вводят адъюванты — вещества разнообразной химической природы, неспецифически стимулирующие иммунный ответ к различным антигенам. В качестве адъювантов используют: гидроксид алюминия, аэросил, минеральные масла, ДЭАЭ-декстран, сапонин; кроме того, используют синтезированные вещества — мурамилдипептид, полианионы, поликатионы и др. Механизмы действия адьювантов разнообразны и до конца не изучены. Одни из них вызывают воспалительную реакцию, другие способствуют депонированию антигенов и замедляют их гидролиз, третьи способствуют усилению поглощения антигенов макрофагами и антиген-представляющими клетками.
К адъювантам предъявляют следующие требования: они должны быть нетоксичными в используемых дозах, не вызывать побочных реакций в организме, сами не обладать антигенной активностью, должны стимулировать развитие длительного гуморального и клеточного иммунитета.
После добавления адъюванта вакцину контролируют на отсутствие посторонних контаминантов (бактерий, грибов) путем посева на питательные среды (МПА, МПБ, МППБ, Сабуро или Чапека). Роста микроорганизмов не должно быть. Затем вакцину фасуют во флаконы и этикетируют. Окончательный контроль вакцины на основные показатели: авирулентность, стерильность, безвредность, допустимую степень реактогенности (на восприимчивых животных), антигенную и иммуногенную активность (на лабораторных и восприимчивых животных) осуществляют государственные контролеры в соответствии с техническими условиями на данный препарат.
Инактивированные вакцины отличаются большей стабильностью свойств, они безопаснее. Их применяют для животных любого возраста и в репродуктивных стадах. Такие вакцины используют преимущественно с профилактической целью в благополучных хозяйствах и угрожаемых зонах. Однако эти вакцины имеют некоторые недостатки:
- технология их изготовления гораздо сложнее, что связано с необходимостью получения большого количества вируссодержащего материала, очистки, концентрации антигена, инактивации вирусного генома и включения в состав вакцины адъювантов;
- необходимо проводить прививки многократно и в значительных дозах;
- они индуцируют менее напряженный и длительный иммунитет, чем при использовании живых вакцин;
- применять их возможно только парентерально;
- они слабее стимулируют Т-систему иммунитета и местный иммунный ответ, поэтому резистентность слизистых оболочек верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта бывает менее выражена, чем после применения живых вакцин;
- способны иногда вызывать аллергическое состояние после повторной вакцинации.
Технология производства инактивированных вакцин сложнее, чем живых вакцин, и состоит из следующих этапов:
- выбор производственного штамма;
- культивирование вируса в биологической системе;
- определение концентрации вируса (антигена);
- инактивация, очистка и концентрация вирусного материала;
- добавление адъюванта;
- внутрицеховой контроль;
- расфасовка, этикетирование;
- заключительный контроль на стерильность, авирулентность, безвредность, реактогенность, антигенную и иммуногенную активность.
Помимо традиционных цельновирионных вакцин (живых, инактивированных) разработаны методы создания вакцин новых поколений: субъединичных, синтетических, получаемых методами генной инженерии. Совершенствование вакцин шло в направлении снижения количества балластных компонентов, снижения реактогенности и повышения иммуногенности препарата.