Дискодиффузный метод (ДЦМ) наиболее распространен в лабораторной диагностике, так как он обладает рядом преимуществ — доступность тестирования, низкая себестоимость, возможность определять чувствительность антибиотиков в конкретной клинической ситуации, высокая воспроизводимость результатов.
Принцип метода. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков, которую измеряют линейкой. На поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию тестируемого микроорганизма определенной плотности; затем помещают диски, содержащие антибиотик, на расстоянии 20…25 мм друг от друга и далее измеряют зону подавления.
Выбор средств для тестирования. Международным стандартом среды для тестирования микроорганизмов является среда Мюллера-Хинтона. Стандартами NCCLS (Национального комитета клинических лабораторных стандартов США) предполагается использование именно этой среды или ее стандартизированных модификаций.
В большинстве микробиологических ветеринарных и медицинских лабораторий в России для оценки чувствительности выделяемых культур ДЦМ используют среду АГВ. Существенным недостатком этой среды является отсутствие стандартизации по содержанию двухвалентных катионов (кальций, магний, цинк), а также тимина и тимидина. Ввиду этого среда АГВ непригодна для определения антимикробной чувствительности к сульфаниламидам и ко-тримоксазолу в отношении всех микроорганизмов, а также при определении чувствительности Р. aeruginosa к имипенему, амино-гликозидам, фторхинолонам. Для определения чувствительности к макролидам и азитромицину на среде АГВ следует использовать диск с эритромицином.
При исследовании S. aureus на чувствительность к оксациллину (для выявления MRSA-штаммов) используется диск с 1 мг оксациллина. Зона задержки роста для чувствительных штаммов S. aureus составляет 13 мм и более, промежуточного уровня — 11…12 мм, устойчивых — 11 мм и менее. При этом следует учитывать, что все чувствительные к оксациллину штаммы стафилококка считаются чувствительными к цефалоспоринам I, II и IV поколения, ингибиторзащищенным пенициллинам и карбапенемам, а все устойчивые к оксациллину штаммы устойчивы ко всем β-лактамам (цефалоспорины, ингибиторзащищснныс пенициллины, карбопенемы) независимо от получаемых при тестировании на чашках зон задержки роста.
Для коагулазонегативных стафилококков зоны задержки роста, равные 18 мм и более, характеризуют чувствительность, 17 мм и менее — устойчивость к оксациллину.
Тестирование S. pneumoniae на чувствительность к пенициллину на среде АГВ с 5 % дефибринированной бараньей крови возможно при использовании диска с оксациллином (1 мг). При этом штаммы с зоной ингибиции 20 мм и более считаются чувствительными к пенициллину, амоксициллину, цефалоспоринам и карбапенемам. Штаммы с зоной подавления 19 мм и менее могут быть устойчивыми, промежуточно чувствительными или чувствительными. Для их оценки необходимо определять МПК. Непосредственное использование дисков с пенициллином, ампициллином, цефалоспоринами, карбапенемами приводит к ошибкам.
В настоящее время отсутствуют сведения о возможности использования среды АГВ для тестирования Enterococcus spp.
Постановка ДДМ. Включает несколько этапов.
Приготовление чашек с питательной средой. Приготовление чашек Петри с плотной питательной средой связано с рядом особенностей. Среду готовят в соответствии с инструкцией. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливают на строго горизонтальную поверхность. Глубина агарового слоя должна быть 4 мм, что достигается внесением 25…30 мл расплавленного агара в чашку диаметром 100 мм или 60…70 мл в чашку диаметром 150 мм. Соблюдение указанных условий связано с тем, что при увеличении толщины слоя агара уменьшается диаметр зон подавления роста в различной степени для разных антибиотиков, что может быть ошибочно расценено как резистентность. В то же время при недостаточной толщине слоя агара может происходить отраженная диффузия антибиотиков от дна чашки; это приводит к формированию больших зон подавления роста, и штамм может быть ошибочно оценен как чувствительный.
После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для застывания среды. При использовании свежеприготовленных чашек перед инокуляцией бактериальной взвеси их надо подсушить, что достигается выдерживанием при 37 °С с приоткрытой крышкой в течение 10…20 мин.
Хранить их можно в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4…8 °С в течение 7…10 сут. Перед использованием их необходимо подсушить.
Приготовление суспензии и инокуляция. Бактериальную суспензию исследуемой культуры готовят в свежем бульоне или физиологическом растворе из 16…18-часовых колоний, выросших на плотной неселективной среде, соответствующей потребностям вида (МПА, КА и др.), или 5…6-часовой бульонной культуре. Плотность приготовленной суспензии должна соответствовать (1…2) ∙ 108 КОЕ/мл Е. coli. Такую плотность можно получить без особой погрешности при разведении в 2 раза бактериальной суспензии оптической плотности 5 ед. стандарта ГИСК им. Л. А. Тарасевича. В течение 15 мин после приготовления 1…2 мл суспензии наносят на поверхность агара, равномерно распределяя покачиванием, и удаляют избыток жидкости пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10…15 мин.
Более удобно использование стерильных ватных тампонов. Тампон погружают в приготовленную суспензию, избыток влаги удаляют, отжимая его о стенку пробирки. Инокуляцию на поверхность питательной среды проводят штриховыми движениями, периодически поворачивая чашку Петри на 60°.
Наложение дисков и инкубация. На поверхность питательной среды не позднее чем через 15…20 мин после инокуляции накладывают диски с антибиотиками, но только при отсутствии неадсорбированных остатков бактериальной суспензии. Диски размещают с помощью стерильного пинцета. Расстояние от края чашки и между дисками должно быть 15…20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм приходится не более 6 дисков. Они должны равномерно соприкасаться с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом. Диск нельзя перекладывать на другое место. Испорченный заменяют другим диском.
Чашки непосредственно после наложения дисков помещают в термостат и инкубируют 18…20 ч при 37 °С кверху дном. Увеличение времени между нанесением дисков на поверхность среды и началом инкубации приводит к «преддиффузии» антибиотика и увеличению диаметра зоны ингибиции роста.
Учет результатов. После инкубации рост на поверхности чашки должен быть сплошной и равномерный. Наличие отдельных колоний свидетельствует о том, что суспензия бактерий была недостаточно густой. В этом случае исследование следует повторить. Измеряют зону задержки роста (а не гемолиза) с обратной стороны чашки линейкой на темном фоне в отраженном свете. На кровяном агаре измерение осуществляют с верхней поверхности агара при закрытой крышке.
За зону ингибиции принимают участок полного отсутствия роста, видимый невооруженным глазом. Двойная зона является чаще всего результатом использования смешанной культуры, что требует ее рассева для очистки и повторного тестирования. Не следует обращать внимание на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны ингибиции роста только при особых условиях освещения или увеличения, и едва заметный налет у края зоны. Крупные колонии, выявляемые в пределах четкого участка подавления роста, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или различной резистентности клеток популяции, что требует повторного исследования.
При оценке антибиотикочувствительности роящихся штаммов протея зона задержки роста может быть затянута тонкой вуалеобразной пленкой, которая не мешает установлению границы зоны.
При оценке резистентности к сульфаниламидам и их комбинациям с триметопримом на среде Мюллера—Хинтона границу зоны задержки роста следует учитывать при уровне ингибиции роста 80 %.
При оценке результатов антибиотикочувствительности стафилококков в отношении оксациллина следует учитывать и самые мелкие колонии в пределах четкой зоны ингибиции роста.