Биосинтез антибиотиков, витаминов, аминокислот и других продуктов, получаемых путем ферментации, должен проходить в условиях, исключающих присутствие в питательной среде посторонней микрофлоры.
С этой целью все ферментационное оборудование (аппараты, коммуникации и контрольно-измерительные приборы), соприкасающееся со средой, тщательно стерилизуется. В соответствии с заводскими регламентами проводится проверка на стерильность питательных сред, аппаратов и т. п.
Посторонняя микрофлора может неблагоприятно влиять на процесс ферментации различными способами. Например, непосредственно разрушать клетки продуцента, а также необходимые для синтеза антибиотика метаболиты; образовывать вещества, неблагоприятно влияющие на метаболизм продуцента и таким образом на образование необходимых для синтеза антибиотика метаболитов; поглощать компоненты среды, которые необходимы продуценту для максимальной эффективности процесса. Кроме того, при наличии обильно развивающейся посторонней микрофлоры в среде накапливаются специфические для нее продукты обмена веществ. Эти продукты могут вызвать существенные дополнительные затруднения при выделении и химической очистке антибиотика, что может в конечном итоге отразиться на качестве готового продукта.
Источниками посторонней микрофлоры могут быть некачественно приготовленный посевной материал, плохо простерилизованная питательная среда, воздух и т. д. Серьезное внимание должно быть уделено аппаратуре, где проводится подращивание посевного материала и ферментация.
Для идентификации посторонней микрофлоры широко пользуются микроскопическим методом, особенно при анализе спорового посевного материала. Однако при работе с растущей культурой он не всегда дает надежные результаты. При незначительных загрязнениях посторонние микроорганизмы могут быть определены при условии, если они отличаются по форме клеток или подвижности от продуцента. Без применения специальных методов затруднительным оказывается также отличить живые клетки посторонних культур от убитых. Последние оказываются занесенными в среду вместе с комплексными органическими соединениями, входящими в ее состав.
Наиболее надежным для идентификации посторонней микрофлоры является метод высева нескольких проб культуральной жидкости на питательные среды. Этот метод наиболее надежен, но результаты, как правило, могут быть получены лишь через сутки. Тем не менее при небольших загрязнениях не в каждой пробе оно может быть выявлено. Из-за небольшого количества клеток посторонних микроорганизмов в культуральной жидкости они могут не попасть в тот объем, который взят для высева. Кроме того, обильное развитие продуцента в контрольной пробе может тормозить развитие посторонних культур, присутствующих в среде. Среда, на которую сделан высев, может оказаться неподходящей для развития посторонней микрофлоры. Наконец, рост посторонних микроорганизмов может подавляться каким-либо метаболитом продуцента, например антибиотиком.
По исследованиям ВНИИ антибиотиков в нестерильных культуральных жидкостях пенициллина и стрептомицина встречаются одинаково часто бактерии и дрожжи. Из бактерий 60% приходится на кокки, 25% — на грамположительные палочки и 15% — на грамотрицательные палочки. Большинство культур оказываются устойчивыми к пенициллину и стрептомицину. Этот факт подтверждает, что в действительности заражение в производстве происходит значительно чаще, чем это удается обнаружить, и только накопление антибиотика в среде подавляет чувствительную микрофлору.
Поэтому процесс ферментации считается стерильным, если наличие посторонней микрофлоры не может быть доказано соответствующими методами исследования. Для такой среды предложен термин «производственно-стерильная» среда. Присутствие в среде незначительного количества клеток посторонних микроорганизмов может объясняться тем, что не для всех сред осуществляются необходимые жесткие условия стерилизации в связи с возможностью карамелизации углеводов, глубокого разрушения белков, образования токсических веществ в результате реакции углеводов с аминокислотами.
Характеристика посторонней микрофлоры может в некоторых случаях подсказать источник заражения. Если в культуральной жидкости обнаружены кокковые формы и сенная палочка, то. это указывает, что заражение произошло, по-видимому, и из воздуха. Наличие грамотрицательных палочек, например кишечной, может свидетельствовать о заражении за счет воды.
Не для всех ферментационных процессов посторонняя микрофлора может оказаться опасной. Например, в производстве лимонной кислоты, где процесс идет при кислых значениях pH и характеризуется быстрым нарастанием биомассы, развитие посторонней микрофлоры будет приостановлено. Существуют такие производства, где микроорганизмы за счет своих энзиматических систем осуществляют один из этапов химического синтеза. Этот процесс весьма кратковременный. Не всегда представляется возможность стерилизации полупродуктов синтеза, подвергаемого воздействию фермента. Для таких производств присутствие посторонней микрофлоры не опасно, так как для ведения энзиматической реакции в среду вводят столь большие количества микробной массы рабочей культуры, что единичные представители посторонней микрофлоры на процесс не влияют, а из-за кратковременности не успевают развиваться. К числу таких процессов можно отнести трансформацию стероидов. Несмотря на сказанное, при работе с чистыми культурами необходимо соблюдать правила асептики; они предусмотрены регламентом соответствующего производства.
В производстве антибиотиков, витаминов и аминокислот загрязнение посторонней микрофлорой значительно опаснее. Эти процессы идут при pH среды, близком к нейтральному значению в течение длительного срока. Нарастание биомассы в посевном аппарате происходит довольно медленно. Особую опасность представляет заражение среды посторонней микрофлорой при получении аминокислот, витаминов и антибиотиков, обладающих относительно узким антимикробным спектром. Например, при биосинтезе нистатина и гризеофульвина, антибиотиков, избирательно действующих на грибы и не действующих на бактерии. Бактерии, как известно, представляют наибольшую опасность для заражения в силу своих мельчайших размеров и быстрому размножению.
В производстве антибиотиков, обладающих широким антимикробным спектром (например, хлортетрациклина), заражение менее опасно, так как после достижения определенной величины концентрации в среде антибиотик угнетает развитие посторонней микрофлоры.
Помимо осуществления различных мероприятий, направленных на профилактику заражения, для некоторых производств является возможным введение специальных химических веществ, препятствующих развитию посторонней микрофлоры. Ферментация в присутствии такого антимикробного агента носит название защищенной ферментации. В качестве антимикробных агентов часто используют антибиотики. Например, при биосинтезе рибофлавина штаммами Eremothecium ashbyii было найдено, что добавление пенициллина в ферментационную среду не только устраняет бактериальные загрязнения, но при некоторых концентрациях даже стимулирует образование витамина. Применение хлортетрациклина в высоких концентрациях (20 мг/мл) снижало уровень образования рибофлавина, а в более низких (5—10 мг/мл) подавляло развитие посторонней микрофлоры без влияния на биосинтез. Поэтому, прежде чем применять тот или иной антимикробный агент, необходимо подобрать его концентрацию. Для этого надо проверить, не подавляет ли препарат развитие культуры продуцента и не тормозит ли синтез получаемого продукта. Иногда возникает необходимость провести предварительную адаптацию продуцента к используемому ингибитору. Поскольку процесс ферментации продолжается несколько суток, то необходимо оценить также длительность срока, в течение которого антибиотик в среде не распадается и сохраняет свою антибиотическую активность. Из антибиотиков, которые применяются в качестве антимикробных агентов, следует назвать хлортетрациклин, обладающий наиболее широким спектром и более дешевым, чем другие антибиотики.
Защищенная ферментация в производстве антибиотиков проводится сравнительно редко, однако возможность ее применения необходимо иметь в виду. Особенно это может иметь место при получении кормовых антибиотиков, при отсутствии хорошего технологического оборудования.
Несмотря на высокие требования к асептичности, по средним статистическим данным мировой фармацевтической промышленности, число нестерильных операций в производстве антибиотиков не превышает 5% общего числа ферментаций.
При получении глютаминовой кислоты методом биосинтеза различными штаммами Brevibacterium рекомендуют использовать стрептомицин в сочетании с другими антимикробными агентами: пентахлорфенолом натрия, нитрофуразоном, панфураном и т. д. Перед использованием стрептомицина в качестве защитного агента резистентность культуры Brevibacterium lactofermentum к нему была повышена в 200 раз.