Грипп птиц (классическая чума птиц, экссудативный тиф, браун-швегейская болезнь кур и др.) — острая контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся общим угнетением, отеками, поражением органов дыхания и пищеварения.
Болезнь регистрируется в различных странах мира. В форме классической чумы птиц встречается редко. Чаше проявляется эпизоотическими вспышками в респираторной форме или с преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта.
Вирусы гриппа птиц выделены от кур, индюков, уток, перепелок, фазанов, глухарей, попугаев, цесарок и птиц других видов.
Характеристика возбудителя. Вирус относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Influenzavirus А. Вирионы плеоморфной (различной), чаще округлой формы, диаметром 80—120 нм. Состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, которая образует выступы. Геном представлен односпиральной линейной молекулой минус-РНК, состоящей из восьми фрагментов.
Устойчивость к физико-химическим воздействиям. При низких температурах и в лиофилизированном состоянии вирус сохраняется до двух лет. При температуре 55 °С инактивируется за 1 ч, при 60 °С — за 10 мин, при 65—75 °С — за 2—5 мин. Вирус утрачивает инфекционную активность под воздействием формальдегида, едких щелочей, слабых кислот, хлорсодержащих соединений.
Антигенная структура и активность. Вирионы вируса гриппа кур содержат внутренние антигены — NP, белки М, P1, Р2, Р3 и наружные антигены — гемагглютинин (Н) и нейраминидазу (N). Внутренние антигены индуцируют образование комплементсвязывающих и преципитирующих антител. Наружные антигены обладают гемагглютинирующей активностью и индуцируют нейтрализующие антитела, которые отвечают за напряженность противовирусного иммунитета.
Антигенная вариабельность и родство. Идентифицированы 15 субтипов гемагглютинина и 9 субтипов нейроминидазы с минимальной перекрестной активностью (между субтипами) в серологических реакциях. Внутри субтипа также могут быть вариации.
Антигенное родство изолятов устанавливают в РТГА (для определения сходства по гемагглютинину), в РТНА (для определения сходства по нейроминидазе), в РИД (для определения сходства по гемагглютинину и нейроминидазе).
Культивирование вируса. Все штаммы вируса гриппа птиц в лабораторных условиях размножаются в куриных эмбрионах при заражении в аллантоисную или амниотическую полость. Некоторые штаммы после адаптации размножаются в культурах клеток фибробластов куриного эмбриона, почки обезьян, легких эмбриона человека и других первичных культурах клеток (WI-38, миелобластоза цыплят). Некоторые штаммы образуют бляшки в первичной культуре клеток куриных фибробластов.
Гемагтлютинирующие и гемадсорбирующие свойства. Все вирусы гриппа птиц агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, кроликов, лошадей, овец и других животных. В отличие от вируса ньюкаслской болезни штаммы вируса гриппа птиц агглютинируют эритроциты лошади и овцы, что используется для дифференциации выделенных на эмбрионах штаммов вируса гриппа птиц от болезни Ньюкасла,
Гемадсорбирующие свойства проявляются с эритроцитами кур при культивировании вируса в культуре фибробластов куриных эмбрионов.
Экспериментальная инфекция. Она воспроизводится на курах и цыплятах при любом способе заражения субтипами вируса гриппа A (H7N1 и H5N3). Белые мыши заболевают при интраназальном и интрацеребральном заражениях. Экспериментальное заражение вирусами протекает бессимптомно. Экспериментальная инфекция у естественно-восприимчивой птицы зависит от вирулентности вируса, степени адаптации к биологической системе и сопутствующих инфекций.
Клинические признаки. Различные по вирулентности штаммы вируса вызывают разные формы клинического течения болезни. Для классической чумы птиц характерны депрессия, потеря чувствительности, синюшность слизистых и кожных покровов, отек подкожной клетчатки. Летальность может достигать 80 % и выше. При респираторной форме наблюдают сонливость, чихание, хрипы, одышку, выделения из носа и глаз, взъерошенность, отставание в развитии, снижение яйценоскости у взрослой птицы. Летальность в зависимости от вирулентности штамма, восприимчивости птицы, условий содержания может варьировать от 1 до 80 %. При желудочно-кишечной форме болезни основной клинический признак на фоне угнетения, отказа от корма и снижения яйценоскости — диарея. Гибель не превышает 5 %.
Встречается и бессимптомное течение (особенно среди домашних уток).
Патологоанатомические изменения. При вскрытии у птицы в зависимости от форм течения болезни могут наблюдаться кровоизлияния в паренхиматозных органах, скелетных мышцах, пищеварительном тракте, очаги некроза во внутренних органах и ЦНС. Штаммы, обладающие пневмотропным действием, вызывают катаральные воспаления в носовых ходах, синусах, трахеи, легких. В некоторых случаях обнаруживают катарально-геморрагические энтериты, нефриты.
Локализация вируса. Входными воротами для вируса служат в основном верхние дыхательные пути, где вирус проходит первичную репродукцию. Накапливаясь, проникает в кровеносную и лимфоидную системы, откуда вторично попадает в эпителиальные клетки дыхательных путей, паренхиматозные органы, головной мозг, кишечник, эндотелий сосудов (вторичная репродукция).
Источник инфекции — больная птица, которая передает вирус воздушно-капельным путем, а также алиментарным при инфицировании воды и корма фекалиями. Распространять вирус на большие расстояния могут дикие перелетные птицы (лебеди, утки, чайки и др.). В естественных условиях спектр патогенности не однороден и зависит от субтипа. Так, субтип H7N1 вызывает классическую чуму птиц чаще среди семейства куриных, и к нему менее восприимчивы водоплавающие птицы. Дикие утки являются не только переносчиками, но и резервуарами инфекции, вызывая сезонные заболевания среди болотных птиц. Штаммы вируса гриппа индейки патогенны для индеек и кур. Штаммы вируса гриппа кур патогенны для кур и перепелов.
Проблема межвидовой передачи между вирусами гриппа птиц, свиней и человека еще окончательно не разрешена. Дикие водоплавающие птицы являются резервуарами различных субтипов вируса. И в тех популяциях, где они находятся в тесном контакте с людьми, свиньями, могут образовываться за счет генной рекомбинации новые более патогенные штаммы вируса гриппа. Вирус гриппа с формулой H2N2 не выделяется от человека с 1968 г., но изолируется от птиц и в случае реверсии может стать эпидемическим.
Диагностика. Поставить диагноз на грипп птиц можно на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований, имеющих решающее значение.
Взятие и подготовка материала. В лабораторию отправляют патологический материал от больной птицы, взятый в первые 2—3 дня болезни при выраженной клинической картине, или от павшей птицы, или убитой с диагностической целью в острой стадии заболевания.
От больной птицы берут мазки из трахеи и клоаки стерильным ватно-марлевым или поролоновым тампоном, который помещают во флакон с 2 мл физиологического раствора (pH 7,0—7,2) или раствора Хенкса с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 500—1000 ЕД/мл) и доставляют в термосе со льдом. Для ретроспективной серодиагностики в начале болезни и в период выздоровления от больной птицы берут кровь на парные сыворотки. При этом сгусток крови, который остается от первой пробы крови, также отправляют для исследования в качестве вируссодержащего материала.
От павшей или убитой птицы берут кусочки селезенки, головного мозга, трахеи, легких, воздухоносные мешки, синусы, участки кишечника или отправляют свежие трупы (не менее двух-трех).
Лабораторная диагностика. Включает индикацию и выделение вируса, его идентификацию, а также ретроспективную диагностику.
Индикацию вируса проводят экспресс-методами, к которым относятся методы цитоскопии и простого флюрохромирования.
При цитоскопии в мазках-отпечатках со слизистых дыхательных путей, окрашенных одним из методов (по Романовскому, Пигаревскому, Быковскому), в цитоплазме клеток обнаруживают тельца-включения фиолетового (окраска по Романовскому) или ярко-красного (окраска по Пигаревскому, Быковскому) цвета.
Метод простого флюрохромирования позволяет обнаруживать в мазках-отпечатках, содержащих вирус гриппа (с применением раствора акридинового оранжевого 1:10 000), в люминесцентном микроскопе четко очерченные гранулы красного или оранжевого цвета, расположенные в цитоплазме клеток.
Выделение вируса проводят путем заражения куриных эмбрионов, культуры клеток, а также ставят биопробу на цыплятах.
Заражают 9—10-дневные куриные эмбрионы (не менее пяти на одну пробу), которым инокулируют исследуемую суспензию в амниотическую или аллантоисную полость общепринятым методом. Инкубируют яйца в течение 72 ч. Экстраэмбриональную жидкость каждого эмбриона на обнаружение вирусного гемагглютинина исследуют раздельно в капельной РГА с 1%-ной взвесью эритроците кур. При отрицательной РГА проводят еще 3—5 слепых пассажей, используя для заражения КЭ эмбриональную жидкость предыдущего пассажа. Проба считается отрицательной, если в 3—5 слепых пассажах не будет положительной РГА и патогенного действия вируса (гибель КЭ).
Культуру клеток заражают реже, чем КЭ. Для этого используют первичную культуру клеток куриных фибробластов. ЦПД обычно обнаруживают через 24—48 ч, хотя наибольший инфекционный титр вируса (105—107 ЭИД50/мл) наблюдается после 2—5 пассажей. Культуральную вируссодержащую жидкость исследуют в РГА и РГАд.
Биопробу на цыплятах проводят, если первые два метода выделения вируса требуют подтверждения. Инокулируют испытуемую суспензию 2—3-месячным цыплятам любым способом (подкожно, внутримышечно, на конъюнктиву и т. д.). Гибель наступает в зависимости от вирулентности и дозы вируса через 36—72 ч.
Идентификация вируса. РТГА — наиболее простой и высокодостоверный метод идентификации вируса. Реакцию проводят с диагностическим набором, содержащим 15 эталонных штаммспецифических сывороток. Для дифференциальной диагностики с болезнью Ньюкасла параллельно ставят реакцию с эталонной специфической сывороткой против болезни Ньюкасла.
РТГА ставят микро — или макрометодом по общепринятой методике. Сыворотки, используемые в реакции, освобождают от термолабильных ингибиторов, прогревая при 60 °С в течение 30 мин, от термостабильных ингибиторов, пропуская через специфическую сыворотку, CO2 или добавляя кусочки сухого льда. РТГА считают положительной, если сыворотка полностью тормозит гемагглютинирующую активность выделенного вируса.
РТГАд ставят по общепринятой методике в культуре клеток куриных фибробластов. Используют набор эталонных штаммспецифических сывороток (предварительно освобожденных от ингибиторов) и эритроциты кур. Исследуемый вирус считается идентифицированным в РТГАд, если эталонная сыворотка блокирует гемадсорбцию.
РСК используют для определения родоспецифичности выделенного вируса, когда в РТГА не удается установить родственных связей между выделенным (эпизоотическим) и эталонным штаммами вируса гриппа по специфическим сывороткам к ним. В этом случае РСК ставят с эталонными специфическими сыворотками против вирусов гриппа родов А, В, С и устанавливают родовую принадлежность штамма.
PH применяют при некоторых неясных и спорных случаях, поэтому в диагностике используются редко.
РИФ относится к экспресс-методам диагностики. Используют прямой и непрямой варианты, для которых мазки-отпечатки готовят ex tempore от убитой больной или свежепавшей птицы и далее применяют соответственный вариант реакции по общепринятой методике.
К наиболее современным методам идентификации вируса гриппа птиц относится ИФА на основе моноклональных антител к гемагглютинину и внутренним вирусным белкам NP и М, а также ПЦР с двумя типами праймеров на основе неструктурного белка и гемагглютинина.
Ретроспективная диагностика. Основывается на обнаружении антигемагглютинирующих и комплементсвязывающих антител в парных сыворотках. Для этой цели используют серологические реакции.
РТГА. Парные сыворотки исследуют одновременно. Первую пробу хранят при 4 °С или в замороженном виде. Перед реакцией сыворотки освобождают от термолабильных и термостабильных ингибиторов. Реакцию проводят с диагностическим набором, содержащим 15 эталонных штаммов вируса.
Реакцию считают положительной, если титр антител во второй пробе не менее чем в 4 раза превышает титр антител к тому же субтипу вируса в первой пробе.
РСК ставят или с нативной внруссодержащей аллантоисной жидкостью, которую предварительно осветляют центрифугированием, или с диагностическим набором, содержащим эталонные вирусные антигены. Используют как классическую методику, так и микрометод в модификации В. В. Ритовой.
РРГ (реакцию радиального гемолиза) широко используют в настоящее время для иммунологического мониторинга в целях изучения иммунного фона и оценки поствакцинального иммунитета. При использовании эталонных вирусных антигенов удается получить четкие зоны радиального гемолиза с гомологичными антителами в исследуемых сыворотках.
ИФА проводят по твердофазному варианту, и в качестве антигена для сенсибилизации лунок диагностических планшет используют внутренний белок (NP) вируса гриппа А. Титры антител в ИФА в 5 и более раз выше, чем в РСК.
Дифференциальная диагностика. Грипп следует дифференцировать от ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита и ларинготрахеита, а также гемофилеза и миксоплазмоза.
Иммунитет и специфическая профилактика. Основная трудность профилактики гриппа заключается в изменчивости наружных белков вирусов, что приводит к ежегодному появлению новых циркулирующих эпизоотических штаммов, отличных от вакцинных. Поэтому ранняя, своевременная и эффективная диагностика новых штаммов — актуальная задача ветеринарии. Для этого используется радиоиммунный анализ (РИА).
Для профилактики гриппа птиц, вызываемого вирусом H7N1 (классическая чума птиц), применяют отечественные живые вакцины из аттенуированных штаммов Ру и Р5; для профилактики болезни, вызываемой подтипами H1—Н8, отечественные биофабрики выпускают инактивированную β-пропиолактоновую гидроокисьалюминиевую вакцину. За рубежом применяют живую нейраминидазо-N-специфическую вакцину (Англия), масляноэмульсионную вакцину для цыплят-броллеров и кур-несушек (США). Разработан метод получения рекомбинантного вируса гриппа птиц, экспрессирующего вирусные белки, что может использоваться в качестве живой вакцины для домашней птицы.