Глубокое охлаждение биологических организмов предполагает влияние температур от —80° и ниже и относится к экстремальным факторам. Исследование такого влияния, как правило, предусматривает определение устойчивости грибов и выявление механизмов ее на субклеточном и молекулярном уровнях.
При определении пределов устойчивости организма к экстремально низким температурам следует различать устойчивость его в высушенном состоянии и при нормальном содержании воды. Это важно, так как сухой организм вследствие потери большого количества воды находится в состоянии анабиоза. Глубокое охлаждение клетки сопровождается образованием льда, в сухом материале его меньше. Образование льда внутри или вне клетки при охлаждении называется кристаллизацией. Различают несколько типов кристаллов льда: гексагональные, неправильные дендриты, сферулиты. При охлаждении биологических объектов в большинстве случаев образуются дендриты. Сферулиты возникают при большой скорости охлаждения. Образовавшиеся кристаллы льда могут подвергаться рекристаллизации — укрупнению. Рекристаллизация происходит при медленном понижении или повышении температуры и является основной причиной гибели микроорганизмов при их оттаивании. Губительного действия рекристаллизации можно избежать, применив перед охлаждением высушивание организма или его отогревание после охлаждения. Сверхбыстрое охлаждение биологических организмов до экстремально низких температур (температур жидких газов) связано с образованием аморфного льда, а сам процесс получил название аморфизации (витрификации). Обычно он наблюдается при сверхбыстром охлаждении микроскопических объектов. Аморфизация льда как правило, сопровождается образованием микроскопических кристаллов льда.
Таким образом, ведущее значение в отмирании клеточной популяции при пониженных температурах придается форме и размерам образующихся кристаллов льда.
В 1913 г. Keith выдвинул гипотезу, согласно которой клетки в условиях минусовых температур погибают вследствие образования льда, разрывающего клеточные структуры. Впоследствии Heines (1938, цит. по: MacLeod, Calcott, 1976) полагал, что главной причиной гибели микроорганизмов является повышенная концентрация солей вследствие обезвоживания клетки в результате образования льда. Повышенная концентрация солей, в свою очередь, способствует денатурации белка и нарушению целостности цитоплазматических мембран. По Mazur (1966), отмирание клеточной популяции дрожжевых клеток при отрицательных температурах происходит в результате взаимодействия двух факторов: прямого охлаждения и его скорости. Mazur теоретически обосновал условия образования вне- и внутриклеточной кристаллизации льда, показав определяющее значение в этом процессе цитоплазматических мембран.
Следовательно, повреждение микроорганизмов при замораживании сводится к глубоким изменениям в клеточных оболочках и цитоплазматических мембранах. При этом имеет место неуправляемый выход ряда низкомолекулярных соединений: +К, неорганических фосфатов, фосфорилированных сахаров, жирных кислот, эфиров, аминосоединений (MacLeod, Calcott, 1976). Кроме того, образование льда способствует повышению концентрации электролитов в клетке, отрицательно влияющих на целостность цитоплазматических мембран. Можно предположить, что отмеченные выше закономерности должны распространяться и на грибы. Специальные исследования на грибных организмах не проводились.
Получение сверхнизких температур достигается в специальных криостатах, причем для разных объектов необходима тщательная отработка режима охлаждения, в частности его скорости. Л. К. Лозина-Лозинский (1972) предложил различать очень медленное, медленное, быстрое, очень быстрое и сверхбыстрое охлаждение. Очень медленное охлаждение организмов продолжается в течение нескольких часов, а сверхбыстрое охлаждение продолжается менее 5 с. Для микроскопических объектов, в том числе грибных конидий, можно применять быстрое и сверхбыстрое охлаждение и оттаивание.
Нами разработана методика охлаждения монослоя конидий грибов в криостатах, позволяющая получать сравнимые количественные результаты и строить дозные кривые выживаемости грибов. Испытывая пять видов темнопигментированных гифомицетов: Curvularia geniculata, Stemphylium ilicis, S. sarciniforme, Periconia cambrensis, Cladosporium transchelii и его пигментные мутанты Ч-1, К-1 и БМ. Грибные образцы помещали в криостаты, содержащие жидкий гелий и жидкий водород, т. е. выдерживали при температурах соответственно —269 и —255°. Скорость охлаждения и оттаивания — сверхбыстрая. Экспозиции в криостате с жидким гелием варьировали от 5 мин до 29 ч и в жидком водороде — от 5 мин до 2 ч.
Установлена высокая устойчивость изученных грибов к экстремально низкой температуре —269°. Все изученные виды выживали в пределах заданных экспозиций, но уровень выживаемости был различным. По устойчивости к этому фактору они распределились в ряду: S. sarcinilorme > S. ilicis > Curvularia geniculata > Periconia cambrensis > С. transchelii Ч-1 > С. transcheli > C. transchelii K-1 > C. transchelii БМ. Аналогичная зависимость получена при выдерживании конидий тех же грибов при температуре жидкого водорода (—255°). Наибольшей устойчивостью отличались конидии S. sarciniforme (30% после 29-часовой экспозиции) и наименьшей — С. transchelii БМ (0,01% после 1-часового влияния). В нашем случае не подтвердилась зависимость, полученная Козловым и др. (1967, цит. по: Лозина-Лозинскому, 1972), о большей криостойкости мелкоспоровых объектов. По нашим данным, крупные конидии меланинсодержащих грибов отличались большей устойчивостью.
Исследования с целью определения пределов устойчивости указанных видов к сверхнизким температурам и выяснения природы их криопротекторов продолжаются.
В заключение считаем необходимым подчекнуть, что развитию широких исследований по терморезистентности микроорганизмов способствовали практические задачи, связанные со стерилизацией космических аппаратов, но биологический смысл этого явления еще во многом не раскрыт. На фоне интенсивного изучения термофилов сравнительно мало внимания уделяется исследованию термоустойчивости грибов и бактерий других температурных групп. Тем не менее этот вопрос составляет часть общей проблемы изучения приспособленности живых систем к биологически экстремальным температурным условиям.
Температурный стресс вызывает в микробной клетке глубокие структурные изменения, в общих чертах сходные у мезофилов и термофилов, но существенно различающиеся соответствующими значениями летальных экспозиций. Определяющими факторами повышения термоустойчивости являются обезвоживание микроорганизмов и глубокие изменения их клеточных структур. Последние генетически закреплены у термофилов и адаптивные у мезофилов.
В природных условиях постоянно существует возможность кратковременного воздействия на микроорганизмы биологически экстремальных температур, особенно в засушливых южных регионах. Как правило, такое влияние приводит к повышенной сухости воздуха и субстрата, неблагоприятных для вегетативного роста, но приемлемых для переживающих структур: бактериальных спор, толстостенных грибных конидий, склероциев, хламидоспор. Характерно, что терморезистентность спор мезофилов Bacillus subtilis var. niger и Bacillus xerothermodurans значительно превышает таковую термофильных бактерий. Сравнение термоустойчивости покоящихся конидий нескольких культур семейства Dematiaceae, относящихся к типичным мезофильным грибам показало, что она не уступает устойчивости спор типичных термофильных бактерий, термофильного гриба Humicola lanuginosa и в отдельных случаях даже превосходит таковую. Таким образом, высокая устойчивость некоторых мезофилов — представителей семейства Dematiaceae является несомненным преимуществом в жарких и засушливых климатических районах.
Устойчивость к кратковременному воздействию экстремальных температур в одинаковой мере присуща мезофильным и термофильным грибам и бактериям. Следовательно, деление на мезо- и термофилы в таких условиях не подтверждается.
Выяснение особенностей экологии и физиолого-биохимических свойств психрофильных грибов находится на начальных этапах изучения. Еще меньше известно о холодоустойчивости мезофильных и психрофильных видов. Исходя из полученных предварительных данных, мы предполагаем, что заметных различий в устойчивости к экстремальным низким температурам у психро- и мезофильных грибов не будет выявлено.
Источник: Н. Н. Жданова, А. И. Василевская. Экстремальная экология грибов в природе и эксперименте. Киев: Наук. думка, 1982