Довременный эксперимент характеризуется четко разработанными методическими принципами.
Если мы хотим доказать (или опровернуть), например, определенное воздействие какого-то фактора, то этот фактор нужно выделить в чистом виде и устранить возможность помех.
В лаборатории биофизики Института биофизики АМН СССР исследовали свойства липидов из различных органов человека.
Были подвергнуты анализу липиды 22 органов и тканей человека. Образцы тканей тщательно промыли дистиллированной водой, гомогенизовали (размельчили). Затем высушили и растерли в мелкий порошок. Сушка производилась в вакууме, чтобы ни кислород, ни мнкроорганизмы, носящиеся в воздухе не могли разрушить структуру изучаемых молекул липидов. Порошок каждого образца был обработан серным эфиром. Свободные липиды, которые хорошо растворяются в эфире, были, таким образом, экстрагированы. Более прочно связанные с белками липиды экстрагировались горячим этиловым спиртом из образцов, уже подвергнутых воздействию эфира. При экстракции горячим спиртом кроме липидов из образцов выделялись неизбежные примеси нелипидной природы. Поэтому первую фракцию можно назвать свободными липидами, а вторую более осторожно— спиртовой вытяжкой.
При всех измерениях хемилюминесценции были применены фотоэлектронные умножители, охлаждаемые жидким азотом или сухим льдом. Результаты измерений выражались в импульсах за секунду на квадратный сантиметр излучающей поверхности жира. Применялись фотокатоды двух типов: один — наиболее чувствительный к синему и фиолетовому свету (ФЭУ-18), другой — лучше всего реагирующий на красный свет (ФЭУ-22).
Исследование подтвердило, что, когда липиды соприкасаются с воздухом, они излучают фотоны. Непосредственное осуществление эксперимента происходило так: брались образцы тканевых липидов объемом около 1 см3 и помещались в стеклянную кювету с квадратным основанием и длиной ребра в 1 см. Поверхность оставалась открытой, доступ воздуха обеспечивался за счет естественной диффузии.
Суммарное излучение липидов регистрировалось фотоумножителями (ФЭУ-18) уже при температуре 20—30° С. Малая интенсивность излучения не давала возможности снять спектральную характеристику хемилюминесценции, однако грубая оценка, произведенная с помощью фильтров, показала, что наиболее значительная часть излучения относится к зеленой, а несколько меньшая — к синей области спектра. С возрастанием температуры резких максимумов в интенсивности свечения замечено не было.
Интересно, что в то время, как олеиновая кислота излучает с приблизительно одинаковой интенсивностью как в синей, так и в зеленой областях спектра, тканевые липиды преимущественно испускают фотоны более длинноволновой зеленой области. Это заставило проверить, не излучают ли тканевые липиды также в красной и инфракрасной областях спектра, т. е. в еще более длинноволновых диапазонах. Ожидания не были обмануты: оказалось, что все липиды интенсивно испускают световые волны красной и инфракрасной областей спектра.
Нужно заметить, что, несмотря на стремление к чистоте опыта, определявшее всю методику, делать строгие количественные выводы, касающиеся люминесценции липидов, пока не представляется возможным. При любом математическом расчете придется вспомнить, что цвет, интенсивность окраски, плотность, вязкость липидов из различных участков тканей различны, вспомнить… и прийти к выводу, что учесть разницу в многочисленных физических свойствах практически немыслимо. Поэтому желание ученых получить информацию непосредственно от молекулы наталкивается на трудно преодолимое пока препятствие. Носитель информации — фотон, прежде чем попасть в «глазок» фотоумножителя, подвергается воздействию не абсолютно прозрачной среды, сталкивается с посторонними частицами и т. д. Об этом неизбежном зле необходимо помнить и ясно отдавать себе отчет в том, что влияние побочных факторов может искажать истинную картину.
Ошибка, связанная с неодинаковостью оптических свойств, была сведена к минимуму в последующих опытах таким образом: брались 0,25—1%-ные растворы тканевых липидов в олеиновой кислоте. Такие растворы были оптически прозрачны в видимой области спектра и отличались друг от друга по светопропусканию не более, чем на 2—5%. Удельный вес и вязкость этих растворов тоже были примерно одинаковы.
При введении тканевых липидов в окисляющуюся олеиновую кислоту наблюдалось увеличение интенсивности свечения — вспышка. Эта вспышка была тем ярче, чем более окисленная олеиновая кислота бралась в качестве растворителя. Изучалась максимальная интенсивность (высота) вспышки липидов различных органов. Она оказалась наибольшей у свободных липидов, извлеченных из различных отделов нервной системы. Для этих же образцов получились наибольшие значения длительности вспышки и общая сумма ее излучения.
Для того, чтобы судить о количестве молекул, участвующих в хемилюминесцирующей реакции, нужно измерить общую сумму излучения, число всех выделенных реакцией фотонов. Практически же гораздо удобнее измерять именно высоту вспышки, т. е. максимальный уровень интенсивности. Специально проведенные эксперименты показали, что между высотой вспышки и общей суммой свечения имеется прямая зависимость. Поэтому высота вспышки использовалась для характеристики общей световой суммы.
Важнейшей частью работы было сравнение люминесцирующей способности различных образцов свободных липидов с другими их свойствами. Наиболее существенной оказалась параллель между уровнем люминесценции липидов, их антиокислительной активностью и содержанием в них фосфолипидов.
Количественные измерения вносят ценный вклад в науку о люминесценции. Несомненность такой зависимости позволяет разбить все многообразие органов человека, содержащих липиды, на три большие группы. К первой группе можно отнести те органы, свободные липиды которых обладают высокой антиокислительной активностью (30—40%), высоким содержанием фосфолипидов (45—50%) и сильной вспышкой хемилюминесценции. Эта первая группа включает в себя все отделы нервной системы.
Вторая группа органов — селезенка, печень, почки, сердце. Для соответствующих свободных липидов получаются средние по величине значения всех трех показателей. Антиокислительный эффект у них равен 15—30%, содержание фосфолипидов — 8—30%.
Третью группу составляют органы с наиболее низкими значениями всех трех показателей. В число этих органов входят подкожные слои жира, кишечник, поджелудочная железа.
Какой же вывод можно сделать из всех приведенных выше результатов?
В опытах по изучению свечения жиров, о которых говорилось выше, учитывались следующие важные обстоятельства.
Олеиновая кислота, в которой растворялись липиды и вытяжки, представляет собой антибиотик и развитие микроорганизмов в ней невозможно. Экстрагирование липидов с помощью длительной обработки тканей горячим спиртом дает уверенность в стерильности образцов. Участие в люминесценции каких-либо ферментов, подобных люциферазе, исключено, так как действие столь «нежных» и обладающих сложным молекулярным строением веществ, как ферменты, невозможно в среде, состоящей на 99% из олеиновой кислоты, при температуре 60° С — 80° С.
В этих опытах, следовательно, проводилось изучение хемилюминесценции сравнительно простых химических соединений, которые после извлечения из животных тканей уже не участвовали в процессах жизнедеятельности— обмене веществ в организме или ферментативных реакциях. Иначе говоря, изучалась именно биохемилюминесценция, которая и определяет биолюминесценцию.
Свечение веществ, входящих в состав тканей (такими веществами являются, как мы знаем, главным образом липиды), было специально отделено от других форм люминесценции и подверглось тщательному исследованию. Идея опытов состояла в том, чтобы свести к минимуму побочные формы свечения и рассмотреть испускание света молекулами липидов.
На первых страницах этой книги мы описывали экзотических животных, чьи органы излучают таинственный свет. Несколько позже мы узнали, что все виды загадочного свечения, встречающегося в живой природе, возникают как результат сложных процессов жизнедеятельности, что биолюминесценция в большинстве случаев есть следствие воздействия специализированного белкового фермента — люциферазы — на специализированный агент — люциферин.
Теперь же мы говорим о сверхслабом свечении чисто химической природы, характерном для липидов. Причем, липиды в этом случае уже потеряли прямую связь с организмом; они рассматриваются просто как некие химические соединения с такой-то (весьма несложной) химической формулой. Они, правда, извлечены из тканей человека, но, в принципе, эти липиды могли бы быть синтезированы из хранящихся в лаборатории химических элементов.
Есть ли связь между ярким свечением живых существ, обязанным ферментативной биолюминесценции, и недоступным невооруженному глазу излучением окисляющихся липидов? Не увлеклись ли мы, не отклонились ли от темы, не перешли ли незаметно для себя от одной темы к другой?
Не будь у некоторых веществ способности к выбрасыванию фотонов при перестройке молекул — не светились бы и жиры при своем окислении. Отсутствие этой способности не позволило бы светиться плавникам глубоководных рыб и щупальцам спрутов.
Это значит, что мы не вернулись к механическим воззрениям типа «соляной гипотезы», а подошли к сложному и запутанному вопросу с научной позиции — с позиции последовательного анализа сначала простого, затем составного, с позиции ясного понимания неразрывной взаимосвязи живой и неживой материи.