Термин сенсибилизация был введен в фитоиммунологию швейцарским фитопатологом Э. Гойманом.
Под сенсибилизацией подразумевалось повышение реактивности организма, в итоге чего он становится способным к тому, к чему ранее способен не был. В медицинской иммунологии термин сенсибилизация используется уже давно. Например, состояние сенсибилизации развивается после первичного контакта организма с сывороточными белками другого вида животных, в результате чего наступает состояние резко повышенной чувствительности к этим белкам.
Состояние сенсибилизации у растений можно уподобить аллергической реакции животного организма. Аллергия (от греческого аллос — другой, эргон — действие) — повышенная норма реагирования организма животного и человека, наступающая после повторного введения болезнетворных микробов, чужеродных веществ и др.
У растений могут быть две формы сенсибилизации, одна из них развивается под влиянием самого возбудителя болезни, другая — под воздействием содержащихся в нем веществ. Первая форма сенсибилизации встречается в природе. Так, заболевшее растение предохранено от реинфекции тем же, а иногда и другим патогеном. Однако подобная форма иммунитета, по мнению Гоймана, является лишь местной и проявляется либо в самом очаге заражения, либо рядом с ним. Исключение составляют вирусные инфекции, при которых вирусы наводняют весь организм хозяина и всюду вызывают местные защитные клеточные реакции, поэтому на первый взгляд создается впечатление гумморальной иммунизации, что, конечно, не соответствует действительности. Возможно, то же происходит и при трахеомикозах, когда возбудитель по сосудам распространяется по всему растению.
Что касается второй формы сенсибилизации, которая может быть достигнута под воздействием продуктов паразита, то она еще более ограничена в своем проявлении, чем первая. Гойман признавал ее только теоретически, поскольку считал, что в природе она не существует. Он полагал, что ввести в растение какой-либо продукт патогена еще возможно, но распределение его по растительным тканям уже маловероятно.
Мы столь подробно остановились на воззрениях крупнейшего фитопатолога лишь с целью показать, что даже он отрицательно относился к практической возможности иммунизации растений на основе их сенсибилизации. Невозможность иммунизации растений он объяснял двумя обстоятельствами:
1. Растения обладают слишком низкой температурой тела, для того чтобы в их тканях активно протекали защитные реакции. Так, клубень картофеля имеет собственную температуру 0,005° С, тогда как температура человека составляет 36,6° С. Если судить по количеству тепла, освобождающемуся при диссимиляции, то жизненные процессы в организме человека протекают в 7000 раз активнее, чем в клубне картофеля.
2. Клетки растений бедны протоплазмой. Если у животных клетки почти целиком заполнены протоплазмой, то у растений она только образует тонкий пристенный слой, тогда как все остальное пространство (примерно 9/10 объема) занимают вакуоли. А активные ответные защитные реакции протекают именно в протоплазме.
Все это и привело к выводу, что иммунизация растений, основанная на сенсибилизации, если и существует, то локальна и быстро преходяща.
И действительно, последующие исследования показали, что в зараженном растении устойчивость приобретают только клетки, либо расположенные в зоне заражения, либо непосредственно к ним примыкающие. Об этом писал еще Мюллер, основываясь на своих исследованиях по фитофторозу картофеля.
Противоположной точки зрения придерживался Н. И. Вавилов, который считал возможным наличие приобретенного иммунитета у растений. Успехи фитоиммунологии, достигнутые за последнее время, позволили подтвердить его пророческое предсказание. И все началось с обнаружения у патогенов метаболитов, которые распознаются растениями и выполняют у них роль элиситеров защитных реакций, о чем уже шла речь в предыдущей главе нашей книги. Например, оказалось, что элиситер, выделенный нами из возбудителя фитофтороза, липогликопротеидный комплекс вызывает у картофеля системную сенсибилизацию всего растения. Но для этого должпо быть соблюдено, как минимум, два условия: 1) элиситер должен быть отделен от присутствующего у того же паразита супрессора (β-1,3 — β-1,6-глюканов); 2) элиситер должен быть использован в строго определенной концентрации, не большей и не меньшей.
Высокие концентрации элиситера не вызывают сенсибилизации. Впрочем, слова «высокие концентрации» вряд ли вообще применимы к элиситору ввиду его высокой биологической активности. Под высокими концентрациями подразумеваются концентрации элиситера порядка 100 мг/л, которые вызывают процессы образования фитоалексинов и некроза в обрабатываемой ткани. Еще не начав исследований по иммунизации, мы твердо знали, что такие концентрации ни в коем случае не могут быть применимы для иммунизации, даже если бы и вызывали абсолютную защиту растений. Ведь фитоалексины — токсические соединения, обладающие широким спектром антибиотического действия. Однако оказалось, что этот вопрос — чисто риторический, поскольку те концентрации элиситера, которые вызывают в растениях некроз, не только не защищают их от последующего инфицирования, но, наоборот, в ряде случаев вызывают их восприимчивость. Почему же фитоалексины, будучи защитными веществами, не защищают растения, в которых образуются? Видимо, здесь действует тот принцип, о котором мы уже не раз говорили: антибиотическое вещество может оказать защитное действие, только если оно образуется в нужном месте, в нужное время и в нужной концентрации. Ни того, ни другого, ни третьего не происходит при обработке тканей высокими концентрациями элиситера. Фитоалексины при этом образуются заранее, локализуются в тех клетках, которые некротизируются под действием элиситера, да к тому же могут и вообще исчезнуть к моменту инфицирования, поскольку метаболизируются растительной тканью. Паразит же при последующем инфицировании, естественно, обходит погибшие клетки и проникает в соседние интактные, которые уже израсходовали свои пластические и энергетические ресурсы на образование фитоалексинов для соседних некротизированных клеток.
Все дело в том, что фитоалексины в отличие от антител нельзя заготовлять впрок, как это происходит при иммунизации человека и животных. Во-первых, они вскоре после накопления исчезают в ходе метаболизма, так как являются эндогенными ксенобиотиками, а во-вторых, они не могут транспортироваться из одних некротизированных клеток в другие. Антитела же свободно передвигаются по кровяному руслу и могут длительное время сохраняться в нем, поскольку не представляют опасности для организма, а нацелены только на строго специфическую мишень — определенный чужеродный антиген.
Итак, те концентрации липогликопротеидного комплекса, которые вызывают образование некроза, не могут предохранить растения от инфекции. Это могут сделать другие, значительно более низкие концентрации элиситера, порядка 5—10 мг/л. При обработке тканей этими концентрациями фитоалексины в них не накапливаются и клетки не некротизируются, но последние в два раза меньше поражаются совместимыми расами возбудителя фитофтороза, поскольку превращаются в сенсибилизированные.
Хотя такие клетки и не образуют фитоалексины в ответ на обработку элиситером, они оказываются хорошо подготовленными к последующей встрече с инфекцией. Если предварительно обработанные элиситером сенсибилизированные клетки заразить совместимой к ним расой возбудителя фитофтороза, то они значительно скорее, чем контрольные, отвечают реакцией СВЧ, образованием фитоалексинов и раневой перидермы, т. е. быстро и интенсивно реагируют на инфекцию комплексом ответных реакций, позволяющих им быстро локализовать инфекцию. Иными словами, ведут себя как несовместимые.
За счет чего же это происходит? Проведенные электронно-микроскопические наблюдения показали, что в сенсибилизированных клетках происходит определенная перестройка ультраструктуры. В большинстве клеток клубня картофеля в пластидах откладываются зерна крахмала, тогда как протоплазма занимает крайне малый объем и локализуется пристенно. Смысл сенсибилизации как раз и состоит в том, чтобы превратить клетки из метаболитически инертных — запасающих в метаболитически активные — биосинтезирующие. Доля цитоплазмы в сенсибилизированных клетках возрастает, увеличивается число митохондрий, возрастает число лейкопластов. Все это свидетельствует о приведении клеток в боевую готовность в том случае, если им предстоит встретиться с инфекцией.
Однако дело не сводится только к возрастанию общей метаболитической активности клетки. Нет. Такие клетки приобретают специализированные особенности, свидетельствующие о том, что их обмен переключен на синтез фитоалексинов. Последние у картофеля, как это ранее уже говорилось, относятся к числу сесквитерпеноидных соединений. А согласно современным представлениям, терпеноиды в клетке синтезируются в двух типах органел, или, как еще говорят, в двух компартментах. Первый — это агранулярный эндоплазматический ретикулум, а второй — ретикулум пластидного аппарата. Некоторые исследователи считают, что оба компартмента действуют независимо, т. е. одна часть терпеноидов синтезируется в первом, а другая — во втором, другие полагают, что они действуют последовательно. Иными словами, в одних компартментах начинается процесс биосинтеза, в других — он заканчивается. Но это уже детали.
Так вот, в сенсибилизированных клетках происходят именно эти изменения: в ультраструктуре доля агранулярного ретикулума возрастает, увеличивается также количество полиморфных лейкопластов. Все это свидетельствует о том, что сенсибилизированные клетки приобретают отдельные черты, характерные для специализированных терпеноидных клеток. В таких клетках уже осуществляется биосинтез сесквитерпеноидов, а не накапливаются они в силу того, что образующиеся фитоалексины тут же разлагаются в процессе их метаболизма.
Если такие клетки заразить, то им не придется затрачивать время и средства для того, чтобы создавать аппарат для биосинтеза фитоалексинов, он уже подготовлен, и именно поэтому они быстрее и интенсивнее отвечают защитными реакциями на инфекцию. Очень вероятно, что подготовка не ограничивается только биосинтезом терпеноидов, но состоит также в ускоренном образовании фенольных соединений и суберина, которые также несут защитные функции.
Однако главное, что удалось установить, это то, что возникающая под воздействием элиситера сенсибилизация является отнюдь не локальной, но системной. В фитоиммунологии существуют понятия локальной и системной устойчивости, о которых мы вскользь уже упоминали. Локальная устойчивость развивается только в месте развития инфекции или нанесения препарата и не распространяется по растительным тканям. Напротив, системная устойчивость проявляется у растения на расстоянии от точки взаимодействия с патогеном или веществом и захватывает все растительные ткани. Так вот, устойчивость, вызываемая липогликопротеидным комплексом, оказалась не локальной, а системной.
Это значит, что она не ограничивается только теми тканями, на которые был нанесен элиситер, а распространяется от него в глубь клубня. Если клубень картофеля опрыснуть элиситером в сенсибилизирующей концентрации, то через 1—2 дня защищенными окажутся поверхностные ткани, через 3—4 дня — ткани, расположенные за ними, и, наконец, через 7 дней сенсибилизация достигнет середины клубня и весь клубень окажется защищенным от болезней. Для достижения состояния сенсибилизации необходимо время, в течение которого и происходит упомянутая перестройка ультраструктурного аппарата клетки. Пройдет несколько месяцев. И точно так же в таком же порядке сенсибилизация будет постепенно отступать: сначала она исчезнет из центра клубня, потом из его серединной части и последней из периферических слоев.
Мы пробовали усилить защитные свойства индуктора, давая не одну, а две с интервалом в один день обработки клубня. Однако таким образом усилить эффект сенсибилизации не удалось. Зато его можно продлить, если на исходе первичной сенсибилизации еще раз иммунизировать клубни, в результате этого сроки сенсибилизации вдвое удлиняются.
Для сенсибилизации клубня необязательно, чтобы оп весь был обработан элиситером, достаточно его нанести на часть клубня с одним обязательным условием: элиситер должен попасть на глазки. Вероятно, именно через глазки элиситер и проникает внутрь клубня, поскольку покрывающая клубень перидерма является для него естественной преградой. Кроме того, и это наиболее вероятно, сигнал сенсибилизации передается по сосудистой системе клубня, которая подходит к глазкам.
Эффект сенсибилизации оказался настолько сильным, что не ограничивался только клубнями, но распространялся с них на выросшие из обработанных клубней растения и далее на клубни нового урожая. В течение 7 лет опыты, проведенные совместно с Белорусским научно-исследовательским институтом картофелеводства и плодоовощеводства, показали, что предпосадочная обработка клубней картофеля индуцировала устойчивость вегетирующих растений, а затем клубней нового урожая. К весне устойчивость постепенно исчезала и вновь появившиеся растения мало чем отличались по своей устойчивости от контрольных. Об этих опытах подробнее мы будем говорить в главе об иммунизации.
Замечательно, что элиситер, выделенный из возбудителя фитофтороза, защищает клубни не только от фитофтороза, но и от целого комплекса болезней, вызываемых паразитарными грибами (фитофтороза, ранней сухой пятнистости, ризоктониоза и парши). Меньшее поражение этими болезнями наблюдалось как на вегетирующих растениях картофеля, так и на полученном от них урожае клубней. Это не удивительно, поскольку одним из защитных механизмов сенсибилизации является образование фитоалексинов, которые, как известно, подавляют рост многих паразитарных грибов.
Сам индуктор, липогликопротеидный комплекс — не обладает свойством расовой специфичности. Это означает, что он присутствует у всех исследованных рас паразита, независимо от наличия у них генов вирулентности, и с его помощью может быть индуцирована устойчивость у всех сортов картофеля, независимо от присутствия у них генов фитофтороустойчивости. Так и получилось. Иммунизация позволяла защитить от инфекции все исследованные сорта картофеля, даже те, которые не обладают ни одним геном фитофтороустойчивости. Таким образом, неспецифическое действие элиситера в данном случае оказалось на руку исследователям.
Ну а как же специфический супрессор, который, как мы это уже ранее говорили, обладает антиэлиситерным действием и, следовательно, должен препятствовать действию элиситера. Представьте себе, что на поле произрастают защищенные лппогликопротеидным комплексом сенсибилизированные растения и на них попадают споры вирулентных рас возбудителя фитофтороза. Ведь у этих рас есть супрессоры, преодолевающие действие элиситера. Почему же они не снимают его сенсибилизирующий эффект? Значит, либо супрессоры не обладают антиэлиситерным действием, либо комплекс не может защитить растения от совместимых рас патогена. Начались исследования, которые дали следующий ответ. Супрессор может только предотвратить наступление сенсибилизации, вызываемой элиситером, но не может нарушить уже наступившую. Вся суть действия супрессоров, по-видимому, и состоит в том, чтобы предотвратить, не допустить той ультраструктурной перестройки, которая происходит в сенсибилизированных тканях. Если подобная ультраструктурная перестройка уже произошла, то супрессор оказывается беспомощным и ничего не в состоянии сделать. Именно поэтому он не способен нарушить устойчивость в уже сенсибилизированных клубнях и растениях картофеля в полевых условиях.
Какие же защитные реакции, кроме реакции СВЧ, образования фитоалексинов и раневой перидермы могут объяснить высокий уровень устойчивости сенсибилизированной ткани. Отдельные эксперименты позволили предполагать, что в сенсибилизированных тканях ускоряются процессы лигнификации, активизируется процесс образования ингибиторов протеиназ, а также ферментов пероксидазы и полифенолоксидазы.
Совершенно открытым остается интереснейший вопрос о том, что же является химическим посыльным сенсибилизации? Что такой посыльный существует, сомнений быть не может, хотя бы потому, что липогликопротеидный комплекс вряд ли способен проникнуть в ткани внутренних слоев клубня картофеля. Скорее всего, как и в случае со вторичным иммунологическим курьером, здесь имеется некий посыльный, который дает сигнал к сенсибилизации клеток. Однако, что он из себя представляет и как распространяется, пока еще неясно.
Практически сенсибилизация, о которой речь шла в этой главе, является прообразом полигонной, полевой, относительной или неспецифической устойчивости. Об этом свидетельствуют следующие факты: 1) защита от болезней не является абсолютной, а составляет около 50%; 2) защитные свойства не являются специфическими, поскольку проявляются по отношению ко всем исследованным патогенам и их расам.
Однако именно неспецифическая устойчивость, как известно, является наиболее перспективной для селекционеров и позволяет избежать опустошительных эпифитотий и поддерживать в природе то равновесное состояние, которое сложилось между хозяином и паразитом.
Сенсибилизация может встречаться в природе, примером чему могут служить ткани растений, несущие в себе микоризу. Известно, что в таких растениях повышено количество ингибиторов, в результате чего в корне и вокруг него создается токсическая зона, предохраняющая их от поражения многими почвенными микроорганизмами. Таким образом, даже заражение микоризой растение оборачивает себе на пользу, повышая за счет этого свой защитный потенциал. В самом растении устанавливается своеобразный вооруженный мир, который обычен для партнеров — симбионтов; растение сдерживает агрессивность грибов микоризообразователей, не позволяя им из симбионтов превратиться в паразитов, а грибы со своей стороны очень умеренно используют питательные вещества растения.
Сейчас, когда многое прояснилось, можно предположить, почему исследователей прошлых лет преследовали неудачи в их попытках иммунизировать растения. Причин этому несколько:
1. Не было известно, чем именно следует иммунизировать растения. Попытки иммунизировать растительные ткани проводились вслепую. Поскольку о существовании элиситеров не подозревали, в рабочие растворы, которыми обрабатывали растения с целью повысить их устойчивость, элиситеры могли и не попадать. Единых методов получения иммунизирующих растворов нет и быть но могло, поскольку элиситеры у разных патогенов различны по химической природе и по-разному локализованы: одни находятся на их поверхности, другие в составе выделений, третьи локализованы внутриклеточно, но выходят из клеток паразитов при соприкосновении с растением.
2. В том случае, если даже элиситер попадал в состав иммунизирующей жидкости, он мог попасть в нее в иной, чем это необходимо, концентрации. Мы уже говорили о том, что, для того чтобы растение оказалось в состоянии сенсибилизации, элиситер в составе рабочей жидкости должен быть в строго определенной концентрации — не большей и не меньшей. Малая концентрация элиситера окажется недостаточной для сенсибилизации, тогда как слишком большая вызовет некроз и образование фитоалексинов. Существует довольно ограниченная область концентраций, в которой элиситер вызывает нужный эффект, и эта концентрация вряд ли может быть случайно достигнута.
3. Если даже допустить, что элиситер оказался в рабочих растворах и попал в них в нужной концентрации, то его действие могло оказаться перекрытым супрессором, присутствующим у этого же патогена. Иными словами, выделить элиситер из паразита, отделив его от супрессора, и затем использовать в строго определенной концентрации вслепую, конечно, не представлялось возможным, чем и объясняются неопределенные результаты прошлых опытов по иммунизации растений,