Экспрессия встроенного гена обеспечивается за счет специальных регуляторных элементов, содержащихся в плазмидном векторе.
Сильный регулируемый промотор, который находится перед клонированным фрагментом, обеспечивает эффективную транскрипцию гена и синтез рекомбинантного белка. При этом очень важно, чтобы встраивание фрагмента ДНК произошло в нужной рамке считывания. В противном случае целевой продукт в клетках синтезироваться не будет.
Для того чтобы клетки-продуценты наработали рекомбинантный белок в высокой концентрации, необходимо оптимизировать экспрессию, т. е. подобрать подходящие условия для наиболее эффективного синтеза этого белка в клетках. Эффективность экспрессии оценивают в процентах целевого продукта от общего (тотального) белка клетки-продуцента.
Кроме того, обязательно исследуют физико-химические свойства рекомбинантного белка, в первую очередь, в какой форме он накапливается в клетке — растворимой или нерастворимой (в виде телец-включений).
Выделение и очистка белков — еще одна серьезная проблема генно-инженерных работ. Ведь необходимо получить максимально чистый препарат, а с другой стороны, при многоэтапной очистке может теряться большое количество белка, а также существенно снижаться его активность (если, например, это фермент). Поэтому стремятся найти эффективный способ, который позволял бы чистить рекомбинантные белки в один прием. Одним из таких решений является технология химерных белков. Химерные белки представляют собой конструкцию, состоящую из целевого белка и какого-либо ситабильного белка (носителя). Получение такого слитного белка программируется на уровне ДНК: в рекомбинантной ДНК гены этих белков экспрессируются вместе в одной рамке считывания. Такие химерные белки имеют ряд преимуществ:
- продукт клонированного гена оказывается защищен от протеаз клетки-хозяина;
- стабилизирующий белок может способствовать правильной укладке целевого белка;
- химерные белки упрощают процедуру очистки;
- полученные с помощью этой технологии белки можно легко иммобилизовать на твердых носителях, что бывает необходимо при разработке диагностических систем.
Способы выделения и очистки рекомбинантного белка зависят от того, где он накапливается: в культуральной среде или внутри клетки. Если белок концентрируется в цитоплазме клетки-продуцента, то необходимо сначала разрушить клеточную стенку, а затем выделять целевой продукт. Если белок секретируется в культуральную жидкость, то проводят осаждение биомассы центрифугированием, а затем выделяют белок из культуральной среды, очищают и исследуют свойства полученного продукта.