Каждый знает со школьных лет, что все животные и растения состоят из огромного числа клеток.
Известно и другое: есть животные и растения, которые состоят лишь из одной-единственной клетки.
В школе с устройством клеток — кирпичиков, из которых построены все живые организмы, знакомились, рассматривая в микроскоп кожицу лука. Это тонкая прозрачная пленка, выстилающая внутреннюю поверхность сочных листьев луковицы. В микроскоп видно, что она состоит из вытянутых прямоугольников. В каждом из них находится округлый пузырек — ядро. Снаружи клетка «одета» оболочкой. Ядра в клетках кожицы лука чаще всего располагаются близко к оболочке, так как основную часть клетки занимают пузырьки — вакуоли. Эти пузырьки заполнены клеточным соком. Между вакуолями и оболочкой видны тонкие тяжи мелкозернистого вещества — протоплазмы. Оболочки клеток тесно примыкают друг к другу, так что общая картина кожицы напоминает стену дома, сложенного из кирпичей.
Клетки микроскопически малы. Чаще всего их размеры — несколько микрон или несколько десятков микрон. Форма и размеры их зависят от того, какой ткани животного или растения они принадлежат. Даже клетки одного организма, например человеческого, очень разнообразны по форме — в зависимости от того, какую работу выполняют они в организме. Клетки мышц на первый взгляд не похожи на клетки крови. И те и другие, в свою очередь, отличаются от клеток нервной ткани. И все-таки во всех клетках очень много общего.
Давайте проследим, как шло изучение клетки, каковы современные представления о ее строении.
Еще в прошлом веке ученые поняли, что, только изучая эти структурные единицы жизни, можно ответить на главные вопросы биологии: что такое жизнь? Чем живое отличается от неживого? Сотни и тысячи исследователей, вооруженных микроскопами, устремились в микроскопический мир жизни. Одни посвятили себя изучению изящных одноклеточных животных — инфузорий. Других интересовало строение многоклеточных организмов и в первую очередь — человека.
Когда изучение клеточного строения организмов только начиналось, считали, что клетки — это «пузырьки», заполненные полупрозрачным слизистым соком, напоминающим сырой белок куриного яйца. Несовершенные микроскопы того времени не позволяли разглядеть внутреннее устройство клетки.
Первым сложное ее строение обнаружил чешский ученый Пуркинье.
Если разбить птичье яйцо и вылить его содержимое на блюдце, то в центре желтка можно заметить светлое пятнышко — зародыш. Рассматривая его в микроскоп, Пуркинье обнаружил, что среди мелких зернышек и пузырьков, взвешенных в полужидком веществе, видно округлое тельце с плотным зернышком внутри. Это было ядро клетки. Ученый назвал тогда ядро зародышевым пузырьком, а окружающее его полужидкое вещество — протоплазмой. Потом ядра были обнаружены почти во всех клетках, а более плотное зернышко внутри ядра было названо ядрышком.
В течение многих лет внимание ученых было приковано к ядру. Его считали главным органом клетки, так как оказалось, что оно связано с важнейшим жизненным процессом — размножением.
Рассмотреть строение живой клетки совсем не просто, даже если в вашем распоряжении имеется вполне совершенный микроскоп. Среди одноцветной полупрозрачной цитоплазмы даже ядро — самая крупная деталь — видно не всегда. Но задача становится особенно трудной, когда под объективом микроскопа оказываются такие неугомонные существа, как, например, инфузории. Они беспорядочно снуют туда-сюда, постоянно ускользая из поля зрения. Можно взять более «солидных» представителей мира одноклеточных — амеб. Амеба движется медленно, и все же и ее протоплазма тоже находится в постоянном движении. Поэтому, как ни странно, чтобы рассмотреть устройство живой клетки, ее нужно убить, или, как говорят биологи, зафиксировать.
При фиксации все жизненные процессы в клетке прекращаются. В этот момент ее можно сравнить с кадром остановившейся киноленты. В качестве фиксаторов используют вещества, быстро убивающие клетки — спирт, формалин, растворы сулемы, осмиевой кислоты и др. Лучшими фиксаторами считают те, которые меньше других разрушают клетку, лучше сохраняют детали ее строения.
Ну, а если мы хотим увидеть не одноклеточных животных, а, скажем, строение листа, или узнать, из каких клеток состоят мускулы у животных? Сколько бы мы ни смотрели на лист, мы ничего не увидим, кроме паутины тонких жилок на его поверхности. Если же мы положим лист под микроскоп, то мы вообще ничего не увидим, потому что предмет, рассматриваемый под микроскопом, должен быть прежде всего тонким и прозрачным.
В 1667 году англичанин Роберт Гук острым перочинным ножом сделал тонкий срез с пробки, положил его под микроскоп и обнаружил, что она состоит из «клеток». С тех пор успехи в изучении клеточного строения живых организмов неизменно связаны с усовершенствованием техники приготовления достаточно тонких срезов. Для этого были созданы специальные приборы — микротомы.
Большой клинообразный нож движется по направляющим рельсам. На пути его движения находится «столик» с укрепленным на нем объектом. Этот столик с помощью винта можно поднимать и опускать на желаемую высоту. Экспериментатор одной рукой поворачивает винт и поднимает столик, а другой передвигает нож. При движении нож срезает верхнюю часть объекта. Срез остается на верхней грани ножа, который возвращается в исходное положение.
Несложно сделать тонкий срез со стебля или корешка растения. Растительные клетки окружены плотной оболочкой, и это придает тканям растения твердость. А попробуйте получить тонкий срез с мягкого кусочка печени или мышцы. Это вам не удастся. Однако довольно тонкий срез можно сделать с замороженного материала. Для этого нужно работать на специальном замораживающем микротоме: в нем столик сильно охлаждается, и объект затвердевает. В других случаях, чтобы придать жесткость изучаемому объекту, кусочки предварительно фиксируют, а затем погружают в жидкий парафин — в термостате (ведь парафин плавится при 56 градусах). Вынутый из термостата парафин застывает. Кусочек застывшего парафина вместе с заключенным в него объектом — так называемый «блок» — укрепляют с помощью горячего скальпеля на столике микротома. Теперь можно резать.
Давайте посмотрим, как выглядят под микроскопом клетки печени. Несколько поворотов подающего винта — и блок на уровне ножа. Каждый поворот винта поднимает столик с блоком на несколько микрон, а скользящий по рельсам нож срезает с блока тоненькую пластинку парафина вместе с заключенным в нем кусочком печени. Поворот винта — движение ножа — срез… Еще раз и еще. Мягкой акварельной кисточкой переносим срезы на предметное стекло, смазанное белком. Белок приклеит срезы.
Теперь их нужно покрасить.
Немые помощники
Уже давно ученые заметили, что разные красители по-разному расцвечивают клеточные структуры. Ядра, например, хорошо красятся щелочными красками, а цитоплазма — кислыми. Чаще всего цитологи используют смесь красок, чтобы выявить расположение химических веществ в клетке. Смесь щелочного азура и кислого эозина придает структурам ядра темно-синий цвет, а кислый эозин заставляет цитоплазму переливаться всеми оттенками утренней зари. Правда, часть цитоплазмы может окрашиваться и щелочными красками (основными). Такие участки называются базофильными (базис-основание). Особенно ярко выражена базофилия цитоплазмы у молодых клеток. С чем связана эта особенность, мы расскажем несколько позже.
Немало трудов было потрачено, прежде чем ученые пришли к заключению, что способность окрашиваться теми или другими красителями зависит от того, из каких веществ состоят детали клетки. Много интересного узнали исследователи от своих немых помощников — красок. Что же придает ядерному веществу способность связывать щелочные краски? Наверное, какая-то кислота. А базофильным участкам цитоплазмы? Ведь они окрашиваются так же, как и ядро, — азуром. Здесь цитологам помогли биохимики. Из ядер зобной железы (тимуса) они выделили вещество, получившее название тимонуклеиновой кислоты. Кислые свойства придавали ей входившие в состав его молекулы остатки фосфорной кислоты.
К 1925 году немецкий ученый Фельген предложил краситель, который исключительно точно позволял установить присутствие тимонуклеиновой кислоты в клетке. Это — основной фуксин. Но прежде чем краситель «укажет» место расположения тимонуклеиновой кислоты, он требует, чтобы ему «создали условия». Поэтому сначала фиолетовый фуксин обесцвечивают, нагревая его с соляной кислотой и бисульфитом натрия. В результате получается бесцветная жидкость — фуксинсернистая кислота. Этот раствор необходимо хранить в темноте, так как на свету фуксинсернистая кислота разрушается.
Срезы тоже требуют специальной обработки. Их нагревают со слабой соляной кислотой, чтобы входящий в состав тимонуклеийовой кислоты сахар — дезоксирибоза — превратился в альдегид. Стекла со срезами опускают в раствор фуксинсернистой кислоты и ставят в затемненное место. Приблизительно за час альдегид, образовавшийся в срезах, разрушит фуксинсернистую кислоту и освободит фуксин, который и окрасит ядра клеток в красно-фиолетовый цвет.
Но что же получилось? Ведь окрасились только ядра. А те участки цитоплазмы, которые красились так же, как ядра, смесью азура с эозином, не окрашены. Значит, тимонуклеиновой кислоты там нет? Совершенно верно. Базофилия цитоплазмы (то есть способность окрашиваться щелочными красками) зависит от другой нуклеиновой кислоты, которая хотя и похожа на ядерную, но отличается тем, что в состав ее молекулы входит другой сахар — рибоза. Поэтому, в отличие от дезоксирибонуклеиновой кислоты ядра (ДНК), ее называют рибонуклеиновой (РНК).
Можно ли покрасить срезы так, чтобы были видны одновременно обе нуклеиновые кислоты? Оказывается, можно. Такой способ окраски предложил немецкий гистолог Унна. Он состоит в обработке срезов смесью двух красок — метилового зеленого и пиронина. При этом цитоплазма становится красноватой, а хроматин ядра окрашивается в зеленый цвет. Этот способ окраски сыграл большую роль в изучении процессов, происходящих в живой клетке.
Применение разнообразных красителей послужило началом развития новой науки — цитохимии. Цитохимические методы давали возможность говорить не только о морфологии (строении) клетки, но и о химическом составе ее деталей, об изменении этого состава в разные периоды «жизни» клетки.
О чем рассказали краски
Вполне понятно, что прежде всего ученые стремились разгадать тайну деления клетки, понять те сложные превращения, которые происходят в ядре.
Ядро окрашивается неравномерно. После фиксации внутри него видны зернышки и глыбки сильно окрашенного материала. Это вещество получило название хроматина (хром — в переводе означает краска). Форма и количество хроматиновых глыбок меняются в зависимости от возраста и состояния клетки. Хроматиновые структуры погружены в ядерный сок — нуклеоплазму, в отличие от которой все остальное вещество клетки называют цитоплазмой.
С тех пор как открыли ядро, ученые потратили много времени и сил, прежде чем разобрались в картине деления клетки. При делении ядро претерпевает ряд сложных, строго последовательных превращений. Главное событие здесь — образование из хроматина интенсивно окрашивающихся телец — хромосом («хрома» — краска, «сома» — тело). Число хромосом, их форма всегда строго постоянны для данного организма (животного или растения). После образования хромосом ядро теряет оболочку, и хромосомы свободно располагаются в цитоплазме. Затем в жизни клетки наступает важнейший момент — расщепление или удвоение хромосом. С ювелирной точностью хромосомы делятся вдоль, и вот вместо одной старой (материнской) хромосомы образуются две дочерних, совершенно одинаковых. Вслед за этим хромосомы расходятся к противоположным концам клетки. Там они «группируются», «одеваются» новой оболочкой, образуя дочерние ядра. В это же время цитоплазма делится пополам. Вместо одной получаются две новые, совершенно одинаковые клетки.
Около пятидесяти лет умы ученых занимал вопрос деления клетки. О цитоплазме почти забыли. Главным «органом» считалось ядро, и, естественно, внимание большинства исследователей было направлено на его изучение. К концу прошлого столетия стало ясно, как делится клетка и какое участие принимает в этом процессе ядро. Ученые предполагали, что образующиеся при делении клетки хромосомы служат для передачи наследственных признаков от материнской клетки дочерним. Однако ничего определенного о способе передачи наследственных признаков с помощью хромосом известно не было. В то время цитология (наука о клетке) была чисто описательной наукой.
В 1875 году немецкий биолог Рихард Гертвиг, изучая деление клеток в зародыше морского ежа, заметил лучистое образование, расположенное в цитоплазме рядом с ядром. Так был открыт еще один «орган» клетки, получивший название клеточного центра. Чтобы избежать путаницы, «органы» клетки стали называть органеллами, или органоидами, в отличие от органов тела — сердца, легких, желудка и т. д.
Оказалось, что клеточный центр принимает в процессе деления клетки самое деятельное участие. Две точки, окруженные лучистым венцом цитоплазмы — центросферой, при делении клетки расходятся к ее полюсам, а между ними натягиваются нити веретена. Эти точки получили название центриолей. Нити веретена прикреплены к половинкам хромосом, лежащих в центральной плоскости клетки. Сокращаясь, эти нити растаскивают половинки хромосом к центриолям, где и образуются дочерние ядра. Поэтому в только что образовавшихся клетках клеточный центр представлен только одной центриолью, но ко времени следующего деления этих дочерних клеток центриоль удваивается. Цикл повторяется снова.
К концу XIX века было известно, что цитоплазма большинства клеток окружена тонкой оболочкой, внутри них находится ядро, рядом с ядром расположен клеточный центр с двумя центриолями. Остальная цитоплазма казалась бесструктурной.
Цитологи продолжали упорно совершенствовать методы фиксации, подбирали новые красители для цитоплазмы. И вот в 1898 году были открыты последние главные органоиды клетки — митохондрии и аппарат Гольджи.
Любимым методом выявления клеточных структур итальянца Камилло Гольджи было серебрение. Гольджи изучал строение нервных клеток. Он фиксировал нервную ткань в растворах хромовой кислоты, а потом обрабатывал препараты раствором азотнокислого серебра. Соли серебра довольно нестойки. Даже небольшие загрязнения растворов или посуды органическими веществами вызывали восстановление азотнокислого серебра до металлического в виде черного осадка. Особенно сильно соли серебра восстанавливали жиры. Поэтому растворы азотнокислого серебра и были хорошими красителями для нервных клеток, богатых жироподобными веществами.
На препаратах нервных клеток совы и кошки Камилло Гольджи заметил новое образование, расположенное недалеко от ядра. Система волоконец и пузырьков, собранных в одном месте и сильно поглощающих серебро или четырехокись осмия, получила название внутреннего сетчатого аппарата, или аппарата Гольджи.
Впоследствии подобная структура была обнаружена почти во всех клетках позвоночных. Предполагали, что аппарат Гольджи связан выделительной функцией клетки. Однако обычными фиксаторами и красителями обнаружить его не удавалось, и поэтому многие исследователи вообще отказывались признавать существование аппарата, открытого Гольджи. Они просто считали его артефактом, то есть закономерным искажением, которое возникает в клетке под действием фиксатора. И только много позже, буквально в последние годы, электронный микроскоп сделал аппарат Гольджи полноправным членом среди клеточных органоидов.
Тот же 1898 год принес еще одно открытие. Немецкий ученый Бенда обнаружил, что при фиксации осмиевой кислотой в цитоплазме клеток появляются многочисленные мелкие зернышки и нити. Так был открыт очень важный органоид клетки — митохондрии (по-гречески «митос» — нить, «хондрос» — зерно).
Бенда просмотрел под микроскопом множество клеток — печеночных, мышечных, нервных и других. Митохондрии присутствовали во всех. Значит, они необходимы для жизни всех клеток! А может быть, они образуются под действием фиксатора — осмиевой кислоты? Нет. Ведь их можно наблюдать и в живой клетке. Правда, они очень малы. Бенда использовал для наблюдения их в живой клетке принцип «темного поля». При этом клетку на столике микроскопа освещают сильным боковым светом, основной поток которого не попадает в глаз наблюдателя.
Митохондрии видны как блестящие извивающиеся нити, подобно тому, как видны пылинки в косо падающем солнечном луче. Эти мельчайшие пылинки невозможно рассмотреть при обычном освещении. Даже при наблюдении в лучшие микроскопы они находились на пределе видимости. Их толщина всего 1—2 тысячных доли миллиметра.
В 1900 году Михаэлис предложил красить их янусом зеленым. Этот краситель метит в живой клетке только митохондрии.
В результате большого числа наблюдений ученые заметили, что больше всего митохондрий в интенсивно работающих клетках, например в мышцах, причем в мышцах курицы их меньше, чем в мышцах голубя: курица летает хуже, чем голубь. Особенно много митохондрий видели в мышцах насекомых. А ведь мышцы насекомых «рекордсмены» по скорости сокращений — они могут сокращаться до тысячи раз в секунду!
Все эти наблюдения подсказывали ученым, что митохондрии каким-то образом связаны с работоспособностью клетки, с клеточной энергией.
Несколько позже было установлено, что митохондрии способны поглощать кислород. И здесь биологам помогли краски. Некоторые специальные краски обесцвечиваются при соединении с кислородом. При этом они переходят в бесцветную лейкоформу. Отдавая кислород, они снова возвращаются в прежнее состояние и приобретают окраску. Проникая в клетку, бесцветная краска окрашивает ее. Значит, она отдает там кислород. Интересно, что чем больше митохондрий в клетке, тем интенсивнее окрашивают ее такие краски. Так, значит, это митохондрии отнимают у них кислород? В таком случае, они, видимо, участвуют в дыхании клетки.
Митохондрии были последним органоидом, обнаруженным в клетке с помощью светового микроскопа. Дальше изучение клетки пошло главным образом по пути выяснения ее химического состава и строения в зависимости от ее роли в организме.
К этому времени у биологов сложилось уже довольно четкое представление о строении клетки. Изображена схема строения клетки, какой в общих чертах представлялась она ученым до появления электронного микроскопа. Конечно, это только схема. В действительности клетки очень разнообразны по форме и размерам. В большинстве из них есть ядро с ядрышком, митохондрии, аппарат Гольджи и различные гранулы, например жировые. Кроме того, клетки животного и растительного происхождения имеют свои особенности. Так, клетки животных содержат клеточный центр с двумя центриолями, а растительные имеют плотную целлюлозную оболочку и вакуоли — пузырьки с клеточным соком.
Растительные клетки отличаются от животных еще и присутствием специальных гранул-пластид. Хлоропласты придают растениям характерную зеленую окраску. От присутствия хромопластов зависит окраска цветов и плодов, а лейкопласты (бесцветные пластиды) служат хранилищами запасных веществ, например крахмала.
За немногими исключениями клетки животных одноядерны и имеют микроскопические размеры (от единиц до нескольких десятков микрон). Размеры растительных клеток могут достигать единиц и даже десятков сантиметров. Например, одноклеточная водоросль ацетабулярия имеет размеры 2—5 сантиметров, а морская водоросль каулерпа достигает нескольких десятков сантиметров. У каулерпы многочисленные ядра лежат в цитоплазме без каких-либо перегородок, что дало повод некоторым ученым считать ее одной гигантской клеткой.
Несмотря на огромное разнообразие клеток по их форме и назначению в организме (растительном или животном), они обнаруживают много общего во внутреннем строении. Так, дыханием во всех клетках ведают митохондрии. Ученые-биохимики обнаружили, что в процессе дыхания принимает участие большое количество самых разнообразных веществ — от очень сложных белковых молекул до неорганических солей.
Не менее сложны процессы синтеза белковых молекул и других веществ, необходимых живой клетке. Опыт ученых-биологов подсказывал, что многочисленные и разнообразные процессы, происходящие в клетках живого организма, должны быть разграничены в пространстве, то есть распределены по определенным структурам клетки. Кроме того, молекулы веществ, участвующих в каком-либо процессе, должны располагаться в строгом порядке относительно друг друга. Разглядеть в обычный микроскоп эти предполагаемые структуры, не говоря уже о составляющих их молекулах, оказалось невозможным. Нужно было найти новые методы исследования.
Световой луч и пучок электронов
В течение трех веков шло непрерывное усовершенствование микроскопа — неразлучного спутника биологов. Шаг за шагам приближались создатели этих «глаз в невидимое» к тем совершенным приборам, которые служат науке теперь. И каждый шаг сопровождался важными открытиями. Ученые разобрались в устройстве органов живого тела, установили клеточное строение организмов, открыли возбудителей многих болезней. Трудно себе представить, как могли бы ученые без микроскопа разгадать те тайны жизни, которые хранит клеточное ядро. И вдруг, когда человек добрался до самых сокровенных глубин живой материи, этот верный и испытанный помощник отказался служить дальше! Те физические законы, которые были положены в основу создания световых микроскопов, стали непреодолимой преградой на пути их усовершенствования.
Дело в том, что в световой микроскоп можно видеть только те предметы, линейные размеры которых не меньше половины длины световой волны. Так, предметы с размерами менее 0,0001 миллиметра находятся уже за пределами «разрешения» цветового микроскопа. Здесь бессильно искусство инженера или ученого. Это порог, поставленный самой природой. Но не зря человек — ее покоритель. Он создал сверхмикроскопы, и самый молодой из них — электронный микроскоп.
В электронном микроскопе вместо пучка света работает пучок электронов, летящих от раскаленной нити — катода, а вместо стеклянных линз — электромагниты, которые фокусируют пучок электронов и управляют им.
Современные приборы дают увеличение до миллиона раз, тогда как лучшие световые микроскопы позволяют увеличивать объекты всего в тысячи раз.
В электронных микроскопах поток электронов разгоняется электрическим полем высокого напряжения — 50—100 тысяч вольт и, пройдя через систему линз, попадает на экран. Под ударами электронов экран, покрытый специальным составом — люминофором, начинает светиться, так же как светится экран телевизора.
Несмотря на то, что ход лучей в электронном микроскопе вполне сходен с ходом лучей в световом микроскопе, принцип создания изображения в них различен. В световом микроскопе изображение создается за счет различного поглощения света, и поэтому применение специальных красителей основано на усилении поглощения света различными участками клетки.
В электронном микроскопе изображение образуется за счет рассеяния электронов. При столкновении с объектом электроны рассеиваются по-разному, и часть из них не попадает на экран. В этом месте экран не будет светиться совсем или будет светиться слабее, если на него попадает меньше электронов. Кроме того, столкновения с объектом уменьшают скорость электронов, а яркость изображения на экране зависит от их скорости. Следовательно, образование изображения зависит от рассеяния электронов, а рассеяние зависит от толщины и плотности объекта и атомного номера составляющих его элементов. Поэтому рассеяние будет сильнее для атомов с большими атомными весами.
Если мы теперь вспомним, что и животные, и растительные организмы состоят в основном из углерода, водорода, азота, серы и фосфора, то есть элементов, атомные веса которых отличаются сравнительно мало, то станет понятным, что изображение таких объектов в электронном микроскопе будет нечетким, малоконтрастным. Это происходит потому, что все эти элементы одинаково слабо рассеивают электроны. Для получения четкого, контрастного изображения используют специальные «красители», но это не те красители, которыми пользуются в световой микроскопии. Электронно-микроскопические «красители» обязательно содержат атомы тяжелых металлов, которые хорошо рассеивают электроны.
При подготовке объекта к исследованию его пропитывают нужным «красителем», тяжелые атомы которого осаждаются на структурах клеток. Чаще всего пользуются четырехокисью осмия, бихроматом калия, перманганатом калия. Кроме того, срезы часто дополнительно «подкрашивают» фосфомолибденовой или фосфовольфрамовой кислотой и гидроокисью свинца. Эти вещества избирательно связываются с некоторыми участками клетки, подобно обычным красителям, которые дают различную окраску клеточных структур в световом микроскопе. Только в электронном микроскопе изображение не цветное, а черно-белое, поэтому «электронные красители» было бы правильнее называть оттеняющими или контрастирующими веществами.
Со времени Роберта Гука методы изучения микроскопического строения биологических объектов совершенствовались параллельно с методами получения достаточно тонких срезов. Если для обычного микроскопа срезы толщиной 0,002—0,003 миллиметра, или 2—3 микрона, считаются очень тонкими, то для электронного микроскопа срезы толщиной даже полмикрона, или 0,0005 миллиметра, практически непрозрачны. Это связано с тем, что проникающая способность электронов очень мала. Чтобы срез можно было изучать с помощью электронного микроскопа, он должен быть очень тонким: в 100—200 раз тоньше, чем для обычного микроскопа. Такие срезы называют ультратонкими или сверхтонкими. Для их получения созданы специальные приборы — ультрамикротомы.
Современные ультрамикротомы устроены так. Объект закреплен на конце металлического стрежня, который движется сверху вниз или по кругу и проходит мимо неподвижно укрепленного ножа. Стержень имеет обмотку, через которую пропускают электрический ток. При нагревании стержень расширяется и подает объект к ножу. Таким образом, каждый следующий срез будет иметь толщину, равную величине линейного расширения стержня за время одного оборота или одного хода.
Для получения сверхтонких срезов очень важно, чтобы материал, который мы будем резать, был достаточно твердым, но пластичным, иначе он будет крошиться. Чтобы придать твердость клеткам или кусочкам тканей, их после фиксации пропитывают жидкой пластмассой, которая затем при нагревании затвердевает. Чаще всего для этого пользуются полиметакрилатом, который. всем хорошо известен под названием плексигласа или оргстекла. Затем маленькие кусочки пластмассы с заключенными в них клетками закрепляют в держателе ультрамикротома.
Особое значение имеет качество ножа. Вначале хороший режущий край пытались получить, тщательно затачивая металлические ножи обычных микротомов. С помощью этих ножей были сделаны срезы толщиной — 0,2—0,1 микрона. Для еще более тонких срезов применяли особо полированные лезвия. Так, были получены срезы толщиной 0,02 микрона и тоньше. Сейчас от металлических лезвий отказались, так как затачивать их долго и сложно.
В современных ультрамикротомах ножами служат определенным образом отломленные кусочки стекла. А в целом ряде лабораторий используют алмазы, которые оказались незаменимыми при резании твердых тканей. Размеры ультратонких срезов так малы (это доли квадратного миллиметра), что за процессом резания наблюдают в микроскоп. К ножу присоединена специальная ванночка, в которую наливают обычно 20-процентный спирт или ацетон. В микроскоп видны срезы на поверхности жидкости. Чтобы можно было перенести срезы в электронный микроскоп, их нужно поместить на какую-нибудь подложку, которая заменила бы предметное стекло обычного микроскопа. Такими подложками служат очень тонкие пленки, которые получают из различных пластикатов. Толщина этих пленок-подложек составляет около 0,02 микрона и меньше. Затем эти пленки укрепляют на металлических сетках с ячейками около 75 микрон.
Для того чтобы поместить срезы на подложку, сетку берут пинцетом и прикасаются к срезам на поверхности воды. Срезы прилипают к пленке. После этого, подсушив сетку, можно поместить ее в патрончик электронного микроскопа.
Сверхтонкая структура клетки
Вот, наконец, у нас в руках маленькая металлическая сеточка с едва различимыми ячейками, в которых поблескивает пленка. Срезы очень малы и тонки, так что простым глазом их не видно. Помещаем сеточку в патрончик, патрончик — в объектодержатель микроскопа. Прошла одна, две минуты… Готово! Мощные вакуумные насосы быстро справились с небольшим количеством воздуха, попавшего в микроскоп вместе с сеточкой. Включаем разгоняющее электроны напряжение и накал нити. Пучок электронов устремляется к экрану, и он вспыхивает ровным зеленоватым. светом.
На экране видны ячейки сеточки, затянутые тонкой прозрачной пленкой, с квадратиками срезов на ней. Поворачиваем ручку управления проекционной линзой — и вот уже одна клетка занимает целый экран. Увеличение в 8000 раз. Как непохожа эта клетка на ту, что мы видели в световом микроскопе! Только ядро занимает полэкрана. Оно заполнено зернистым материалом. Оказывается, хроматиновые глыбки состоят из скопления мелких гранул. Более крупные зерна составляют ядрышко. Тяжи этих зерен расходятся от ядрышка к оболочке ядра.
Ядерная мембрана, окружающая нуклеоплазму, тоже обнаруживает сложное строение. Двуслойная мембрана пронизана множеством отверстий — ядерных пор, через которые может идти обмен веществами между ядром и цитоплазмой. Иногда бывает видно, что тяжи ядрышковых гранул направляются прямо к ядерным порам. А ведь ядрышко состоит из гранул рибонуклеиновой кислоты, той самой, которая была обнаружена в базофильных участках цитоплазмы. Значит, ядро принимает активное участие в цитоплазматических процессах Диаметр ядерных пор — около одной десятитысячной миллиметра. В обычный микроскоп они, конечно, не видны.
Несмотря на все свое совершенство, электронный микроскоп несколько разочаровал исследователей ядра. Наиболее интересные ядерные структуры — хромосомы — оказались слишком велики для изучения их с помощью сверхтонких срезов. Зато сколько интересного рассказал электронный микроскоп о строении цитоплазмы!
Если теперь составить схему строения клетки, то она будет выглядеть совсем по-другому. Вот знакомые нам органоиды — клеточный центр с двумя центриолями, аппарат Гольджи и митохондрии. Но как сложно они устроены! Однако самый большой сюрприз исследователям преподнесла «неорганизованная» цитоплазма.
Взгляните на срез клетки печени. Кроме ядра и митохондрий, наш глаз обязательно остановится на группах параллельных линий, окружающих ядро. При более внимательном наблюдении оказывается, что эти линии попарно замкнуты на концах и образуют систему двойных мембран. Это совершенно новый органоид.
Как бы ни было удивительно сложно строение крошек-митохондрий, но об их существовании знали давно. А с такой структурой цитологи встретились впервые. Этим пачкам двойных мембран нужно было найти место в старой, привычной схеме строения клетки. Оказалось, что это не так трудно. Сопоставляя электронно-микроскопические картины разных клеток с соответствующими данными световой микроскопии, цитологи получили совершенно ясный ответ: участки клетки, занятые стопками двойных мембран, совпадают с базофильными участками цитоплазмы этих клеток. Но ведь двойные мембраны видны в клетке всюду — митохондрии, мембраны Гольджи, клеточная мембрана, а цитоплазма не вся базофильна. Базофилию цитоплазмы уже давно связывали со способностью клетки строить основное вещество жизни — белки. Поэтому было интересно выяснить роль этих «слоеных» участков цитоплазмы в жизнедеятельности клеток.
И вот в 1953 году сотрудник Рокфеллеровского института в Нью-Йорке Паладе показал, что базофилия «слоеных» участков цитоплазмы зависит от мельчайших гранул, сидящих на поверхности этих двойных мембран. После обработки клеток рибонуклеазой — веществом, разрушающим рибонуклеиновую кислоту, эти гранулы исчезли. Исчезла и способность цитоплазмы окрашиваться щелочными красками, то есть ее базофилия. Значит, гранулы — это рибонуклеиновая кислота! Предположения цитологов о роли базофильных участков в клетке подтверждались. Стала понятной базофилия растущих и железистых клеток. В них синтез белка особенна интенсивен.
Электронный микроскоп помог добраться до деталей клетки, которые приходится измерять уже молекулярными величинами. Например, центры синтеза белка — рибосомы, сидящие на двойных мембранах, имеют в диаметре около 150 ангстрем, а расстояние между ларами мембран — около 1000 ангстрем. Дальнейшие исследования выделенных из клетки рибосом показали, что каждая рибосома состоит всего из двух молекул РНК.
Группа двойных мембран с сидящими на них рибосомами получила названия эргастоплазмы (эргастоман — в переводе означает вырабатывать, превращать). Среди мембран эргастоплазмы видны округлые тельца — митохондрии. Как непохожи они на те митохондрии, которые в течение многих лет были загадкой для цитологов!
Мелкие гранулы и нити митохондрий находились на пределе видимости в световой микроскоп. Долгое время их назначение в клетке было непонятно. Некоторые ученые сравнивали их с бактериями и предлагали выращивать отдельно от клетки. Потом было показано, что митохондрии способны поглощать кислород. Опыты с выделенными из клетки митохондриями подтвердили это. В определенных условиях митохондрии действительно могут «жить» вне клетки, правда, весьма недолго. При этом они поглощают кислород и выделяют углекислый газ — дышат. Химический анализ раствора, в котором «живут» митохондрии, показывает, что в результате их «жизнедеятельности» одни вещества исчезают, а вместо них появляются другие. При этом очень точные приборы могут зарегистрировать повышение температуры.
Для сохранения строго упорядоченной структуры и выполнения жизненных функций клеткам необходим приток энергии. Если прибор отключить от электрической сети или машину лишить бензина, то они перестанут работать. Но прибор или машина прекратят работу, оставаясь при этом целыми. Клетки же при прекращении питания начинают терять тонкую структуру, перестают выполнять свои функции, а потом разрушаются. В процессе жизнедеятельности мышечные клетки выполняют механическую работу, нервные клетки вырабатывают электрическую энергию, клетки пищеварительных желез синтезируют вещества, необходимые для переваривания пищи, и т. д. При этом в организме поддерживается определенная температура. Для работы этой «живой машины» и нужен приток энергии.
Подобно тому как турбогенератор или паровоз используют энергию пара, полученную при сгорании угля или нефти, так и живые клетки, «сжигая» питательные вещества, получают необходимую им энергию. Вполне понятно, что клетки живых организмов не могли бы работать при температуре сгорания угля, использовать перегретый пар или электрический ток высокого напряжения. Все процессы в живых организмах протекают при довольно постоянной и сравнительно низкой температуре — около 37° — и в водной среде (ведь протоплазма почти на 80% состоит из воды). Как это происходит?
Чтобы обеспечить клетку необходимой для жизни энергией, природа выработала множество молекулярных механизмов исключительной точности и экономичности. Они-то и размещены в митохондриях. Во всех клетках среди полостей и мембран эргастоплазмы можно видеть их овальные тельца четкой пластинчатой структуры. Снаружи они ограничены двойной мембраной. Внутренний слой этой мембраны образует складки или перегородки, которые называют митохондриальными гребнями или мембранами. Внутримитохондриальные мембраны также двойные. Число их и плотность упаковки зависят от вида клетки. Чем интенсивнее работает клетка, тем плотнее упакованы мембраны внутри митохондрии.
Каждая митохондриальная мембрана имеет толщину 180—200 ангстрем, то есть составлена всего из нескольких слоев молекул. В этих-то мембранах и расположены группы молекул, которые расщепляют питательные вещества, например сахара, с выделением энергии. Однако энергия здесь выделяется не только в виде тепла, как если бы сахар сжигали на воздухе. Освобожденная энергия сразу же используется на синтез специального вещества, хранителя этой энергии, — аденозинтрифосфорной кислоты, или АТФ.
Затем молекулы АТФ направляются к тем структурам клетки, где необходима энергия для различных процессов, например к мембранам эргастоплазмы, где идет синтез белка. Там молекулы АТФ распадаются, и за счет энергии их связей строится новое вещество цитоплазмы.
Известно, что пища животных и человека состоит главным образом из белков, жиров и углеводов. Все эти вещества клетки используют либо как «топливо» (углеводы и жиры), либо как строительный материал (белки). Так, белки при попадании в организм сначала разлагаются на составные части — аминокислоты. Потом из аминокислот в эргастоплазме клеток строятся белки, характерные для данного организма. Но животные могут жить, только поедая других животных или растения. А растительные организмы способны из углекислого газа и воды с помощью энергии солнечного света строить углеводы — вещества, служащие топливом для животных клеток.
Образование углеводов (сахара или крахмала) в клетках растений из углекислого газа и воды идет с помощью специального вещества — хлорофилла, который придает растениям зеленую окраску. Молекулы хлорофилла в клетках растений расположены в мелких гранулах или зернышках — хлоропластах. Присутствие хлоропластов — вот в чем главное отличие растительных клеток от животных.
С помощью электронного микроскопа удалось показать, что хлоропласта, эти главные фабрики производства сахара и крахмала, имеют очень сложное строение. Их слоистая структура напоминает митохондрии. Опять «слоеные пироги». В диаметре хлоропласта достигают 6—7 микрон. Внутри хлоропласта молекулы хлорофилла разложены буквально «по полочкам». Следует сказать, что всякое разрушение слоистой структуры как в хлоропластах, так и в митохондриях приводит к нарушению их работы. Разрушенные хлоропласта не могут синтезировать сахар, а митохондрии расщеплять его с освобождением энергии.
Среди «слоеных» мембран эргастоплазмы и многочисленных митохондрий можно видеть еще один органоид, существование которого в клетках многие годы вызывало споры среди ученых. Это аппарат Гольджи. Со времени его открытия этой клеточной структуре было посвящено очень много работ. Одни доказывали, что он действительно существует в клетках, другие считали, что его образование связано с действием фиксирующих веществ. Окончательно выяснено строение этого органоида было лишь после применения электронного микроскопа.
На срезах аппарат Гольджи чаще всего состоит из чашевидно изогнутой стопки двойных мембран. На их концах имеются скопления пузырьков различного диаметра. От мембран эргастоплазмы Гольджи-мембраны отличаются отсутствием гранул РНК на их поверхностях. В клетке аппарат Гольджи обычно расположен близко к ядру. Несмотря на множество исследований, посвященных этой интересной структуре, значение ее для жизнедеятельности клетки до сих пор не выяснено.
Следует, однако, сказать, что электронный микроскоп помог обнаружить только один действительно новый органоид в цитоплазме — рибосомы. Поэтому главным результатом применения этого мощного современного метода исследования клетки можно считать расшифровку сверхтонкого строения ранее известных органоидов клетки. Электронный микроскоп помог заполнить пробел между молекулярной организацией цитоплазмы и структурами клетки, видимыми в обычный микроскоп.
Самая характерная и поразительная особенность сверхтонкого строения клетки — повсеместное присутствие так называемых мембран.
В любой клетке, животной или растительной, раковой или нормальной, молодой или старой, независимо от ее назначения в организме, мы обнаруживаем одни и те же главные органеллы, имеющие сходное сверхтонкое строение. Различия наблюдаются лишь в количестве тех или иных органоидов и в их размерах.
Таким образом, электронный микроскоп подтверждает единый план организации живого вещества.