При массовых исследованиях используют автоматизированные методы определения чувствительности к антибиотикам с использованием микротест-систем (МТС).
МТС для метода серийных разведений. Как правило, используют готовые стерильные полистироловые 96-луночные планшеты, в лунки которых внесены растворы из лиофильно высушенных антибиотиков в бульоне в убывающих концентрациях. После вскрытия планшета стандартизированную суспензию в одинаковой дозе асептически вносят в соответствующие ряды лунок, закрывают крышкой и инкубируют при оптимальной температуре. После инкубирования отмечают рост (помутнение бульона) в тех лунках планшета, где антибиотик не действует. При наличии помутнения бульона в контроле культуры и опытных лунках определяют величину МПК. Учет можно проводить как визуально, так и с помощью специальных микробиологических анализаторов. В этих приборах имеется возможность автоматизации основных действий: внесения культуры, инкубирования, встряхивания, определения оптической плотности (степени мутности) жидкости в каждой лунке, графическое отображение результатов, определение степени чувствительности и печать протокола исследования.
МТС для метода (теста) пограничных концентраций (по Л. З. Скала и соавт., 2004). Эффективно использование готовых тест-систем по методу серийных микроразведений в варианте пограничных концентраций — тест пограничных концентраций (ТПК). Это избавляет практических бактериологов от наиболее трудоемких подготовительных этапов исследования: приготовления и стандартизации питательных сред с растворами антибиотиков. В этом случае врач получает возможность сконцентрировать свое внимание на получении чистой культуры микроорганизма и стандартизации суспензии.
Выпускаемые в настоящее время тест-системы разработаны на основе стандартных 96-луночных планшетов, что позволяет проводить как визуальный учет результатов, так и автоматизированный с использованием различных спектрофотометров.
ТПКтест — это микротест-система одноразового использования, позволяющая, как правило, определить чувствительность 4 исследуемых микроорганизмов одновременно к 12 антибиотикам или 6 микроорганизмов к 8 антибиотикам. Он представляет собой стандартный 96-луночный полистироловый планшет (8 х 12), в который входят 4 или 6 наборов высушенных растворов (0,05 мл) антибиотиков в питательной среде.
Каждый антибиотик представлен двумя лунками с пограничными концентрациями, позволяющими дифференцировать микроорганизмы по степени чувствительности на три категории: чувствительные, умеренно устойчивые и устойчивые. Большая концентрация соответствует минимальному значению МПК (минимальная задерживающая рост микроба концентрация) для устойчивых штаммов, малая концентрация — максимальному значению МПК для чувствительных штаммов.
Можно заказать 12 антибиотиков по своему усмотрению или 11 антибиотиков, а 12-й ряд оставить для контроля роста культуры.
Выделение культуры. Для выделения чистой культуры используют общепринятые в микробиологии методы. Используют чистую 18…24-часовую культуру с плотной питательной средой или чистую бульонную культуру.
Приготовление бактериальной суспензии. Степень исходной суспензии определяется конечной концентрацией в лунках тест-систем, которая должна составлять 5 ∙ 105 микробных тел в 1 мл. В случае, если при инокуляции к 0,05 мл раствора антибиотика в лунке добавляют 0,05 мл суспензии, концентрация инокулята должна быть 106 микробных тел в 1 мл. Для этого из изолированной колонии готовят суспензию в дистиллированной воде и доводят ее до 10 ЕД по стандартному образцу мутности (ОСО 42-28-59—87). Полученную взвесь разводят в 1000 раз стерильной дистиллированной водой.
Инокуляция. Инкубация. Суспензию бактерий тщательно встряхивают, инокулируют по 0,05 мл суспензии в лунки горизонтальных рядов в систему ТПК4 или вертикальных рядов в ТПК6. После инокуляции планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 18…24 ч при температуре (36+1) °С.
Учет результата. Учет результата проводят визуально по наличию или отсутствию роста испытуемых микроорганизмов, который оценивают по помутнению питательной среды:
- культура чувствительная (S): отсутствие роста в обеих лунках с большой и малой концентрациями антибиотиков;
- культура устойчивая (R): наличие роста в обеих лунках;
- культура умеренно устойчивая (I): наличие роста в лунке с меньшей концентрацией и отсутствие роста в лунке с большей концентрацией.
В настоящее время в ГНЦ антибиотиков (г. Москва) разработаны и выпускаются следующие тест-системы.
1. ТПКтестГР — для грамотрицательных бактерий (11 антибиотиков, тест-система на 4 культуры).
2. ТПКтестГР+ для грамположительных бактерий (12 антибиотиков, тест-система на 4 культуры).
3. ТПКтестСтаф для стафилококков (8 антибиотиков, тест-система на 6 культур).
4. TПKтестTPs для псевдомонад (11 антибиотиков, тест-система на 4 культуры).
5. ТПКтестУротест для возбудителей уроинфекций (12 антибиотиков, тест-система на 4 культуры).
Внедрение в работу микробиологических лабораторий коммерческих микро — тест-систем позволяет стандартизировать определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и, кроме того, внедрить автоматизированные методы для учета результатов.