Способностью связывать атмосферный азот обладают, как уже говорилось, не только симбиотические микроорганизмы.
Азот воздуха усваивают и некоторые виды микробов, свободноживущие в почве. Первый свободноживущий азотфиксатор был выделен из почвы в 1895 году знаменитым русским микробиологом С. Н. Виноградским и назван клостридием Пастера.
Клостридий Пастера имеет интересную физиологическую особенность: он не переносит кислорода; это так называемый анаэроб. В присутствии кислорода воздуха клостридий может развиваться только тогда, когда по соседству имеются аэробные бактерии, поглощающие кислород и создающие бескислородную атмосферу. Он мало чувствителен к реакции среды и может развиваться как в кислых почвах (pH — 4,5—5,5), так и при щелочной реакции (pH — 8,0—9,0). Довольно большой устойчивостью к внешним воздействиям обладают и споры этого микроба: они в течение нескольких минут выдерживают нагревание до 96° и остаются жизнеспособными.
Развиваясь на питательных средах, включающих различные углеродсодержащие вещества, например, сахара, клостридий разлагает их, образуя масляную и уксусную кислоты, углекислый газ и свободный водород. Процесс разложения органических веществ в бескислородной среде носит название брожения. Анаэробным организмам он заменяет дыхание и также служит источником энергии для всех процессов жизнедеятельности.
Если в питательной среде нет связанного азота, но есть углеводы, клостридий вызывает энергичное их брожение, а выделяющаяся при этом энергия идет на усвоение газообразного азота атмосферы.
Долгое время клостридий относили к слабоактивным фиксаторам азота. Пределом его «возможностей» считали от 1 до 3 мг азота на 1 г сброженного сахара. В последнее время обнаружилось, что этот микроб вяло «работает» только на искусственных питательных средах. Когда же изучили его физиологию и применили особую технику культивирования, близкую к условиям, которые окружают микроб в почве, оказалось, что он связывает азот атмосферы значительно энергичнее и дает 10—12, а в некоторых случаях даже 27 мг азота на 1 г сброженного сахара. Надо полагать, что в естественных условиях — в почве — азотфиксация у клостридия еще более эффективна. Поэтому сейчас исследованию этого микроорганизма уделяют большое внимание.
Второй свободноживущий микроб, фиксирующий азот атмосферы, был открыт голландским микробиологом А. Бейеринком в 1901 году. Он получил название азотобактера.
Азотобактер в своем развитии проходит довольно сложный цикл, состоящий из нескольких стадий. Молодые клетки бактерии подвижны и имеют форму палочек размером 2X4 микрона. Позже они превращаются в крупные неподвижные шарики (кокки) диаметром до 4 микрон, которые содержат различные включения (жир, крахмал, белковые тельца и т. д.). Это стадия зрелости. Старые клетки азотобактера теряют подвижность, еще более увеличиваются в размерах и покрываются толстой оболочкой, образуя так называемые цисты. Цисты — это покоящаяся стадия. Они могут прорастать, давая начало молодым клеткам. Размножение азотобактера происходит обычно, как у всех бактерий, простым делением. Но недавно у азотобактера были обнаружены и другие способы размножения.
На твердых питательных средах, не содержащих азотистых веществ, азотобактер образует различимые невооруженным глазом колонии. Они имеют вид маленьких (1—2 см в диаметре) блестящих, слегка вздутых пятен. Колонии представляют собой скопление однородных микробных клеток. Позже пятна увеличиваются в размерах и приобретают окраску в результате образования особого красящего вещества. По окраске колоний можно различать виды азотобактера.
В отличие от клостридия азотобактер довольно «капризен». Он очень чувствителен, например, к кислотности среды и встречается лишь в очень слабокислых и нейтральных почвах. Азотобактер — аэроб; он может развиваться только в присутствии кислорода воздуха. Правда, недавно было установлено, что этот микроб может существовать при очень малом содержании кислорода в почвенном воздухе, примерно таком, какое выдерживают и наименее анаэробные формы клостридия. Это открытие указывает, что азотобактер может участвовать в накоплении азота в почвах с плохим кислородным режимом, например, в почвах рисовых полей.
Энергию, необходимую для жизнедеятельности и фиксации азота атмосферы, азотобактер получает от окисления различных органических соединений, главным образом углеводов (глюкоза, сахароза, крахмал), солей, органических кислот и т. д. Следовательно, он усваивает азот только тогда, когда в питательной среде есть эти вещества. В благоприятных условиях азотобактер фиксирует до 20 мг азота на 1 г сахара.
В последние годы установлено, что азотобактер синтезирует и выделяет в почву различные витамины и ростовые вещества. Эти данные по-новому объясняют его роль в повышении урожайности сельскохозяйственных культур.
Недавно открыта еще одна группа свободноживущих почвенных азотфиксаторов. Это бактерия, которой в честь одного из пионеров изучения азотфиксаторов дано название бейеринкия. Клетки микроба представляют собой прямые или слегка изогнутые палочки, 2—3 микрона в длину и 0,5—1 микрон в ширину. Молодые формы подвижны и несут реснички, расположенные по всей поверхности тела.
Бейеринкия аэробна, развивается на питательных средах с pH — 4,5—9,0 (лучше всего при pH — 5,6—5,8). Этот микроб широко распространен в кислых почвах. Если в среде нет связанного азота, он фиксирует азот атмосферы примерно с тон же эффективностью, что и азотобактер.
Таковы основные, известные нам, микроскопические собиратели азота. Описанными здесь формами не исчерпывается их список, но именно они наиболее широко распространены в природе и встречаются практически во всех почвах, на которых способны жить высшие растения. Разные по образу жизни, способные развиваться только в присутствии кислорода или только без него, с разной формой клеток (палочки, шарики и т. д.), азотфиксируюшие микробы имеют общее чудесное свойство: превращать неуловимый азот воздуха из «вещи в себе» в «вещь для нас».
Современная микробиология располагает достаточно вескими данными, позволяющими утверждать, что химическая деятельность азотфиксирующих микробов проявляется на всех почвах и имеет такие широкие масштабы, которые необходимо учитывать в практике земледелия.
По последним данным, азотобактер содержится приблизительно в 50% всех почв земного шара. Обычно в 1 г почвы можно обнаружить сотни и тысячи клеток этого микроба. В окультуренных почвах его больше, чем в целинных.
Клостридий обнаружен почти во всех исследованных почвах (около 100%). На каждый грамм почвы приходятся сотни тысяч, а иногда и миллионы клеток микроорганизмов (это объясняется меньшей требовательностью клостридия к условиям среды).
На распространение азотобактера оказывает влияние содержание в почве фосфора и кальция. Эти два элемента значительно стимулируют его развитие и жизнедеятельность. В то же время азотобактер не переносит кислой реакции среды. По-видимому, он не может жить в почвах с pH ниже 6. Зато в таких почвах широко распространена бейеринкия. Она была обнаружена в кислых почвах, pH которых не превышал 5,5.
Клостридии также выдерживают значительную кислотность и часто обнаруживаются в почвах с pH = 5,5—5,0 и даже 4,5 (кислый торф). По-видимому, клостридии — единственные азотфиксаторы, обитающие в кислом торфе. В почвах со щелочной реакцией (pH=8,3) клостридии также хорошо развиваются и фиксируют азот. Больше всего их обнаруживается в почвах с нейтральной реакцией (pH = 7,0).
Безусловно, одной из важнейших групп свободноживущих азотфиксаторов, благодаря которым в почву поступает значительная масса азота, являются анаэробные клостридии. Практически нет почв, где клостридии не были бы обнаружены, притом в количествах, во много раз превосходящих другие азотфиксаторы, а по азотфиксирующей активности клостридий не уступает азотобактеру.
Но присутствие в почве свободноживущих азотфиксаторов еще не говорит о том, что в ней интенсивно идут процессы фиксации азота.
Дело в том, что усвоение азота азотобактером и клостридием идет только тогда, когда для них достаточно углеродной пищи, которая дает им необходимую энергию. Если углеводов недостаточно, нет и притока энергии, нет фиксации азота. Здесь два великих кольца природы — азотный и углеродный циклы — тесно соприкасаются между собой. Этим еще раз подтверждается всеобщая связь и взаимозависимость природных явлений.
Могут ли свободноживущие микробы найти в почве достаточно углеродсодержащих соединений для интенсивной фиксации азота атмосферы? Особенно важно это для клостридиев, так как анаэробным бактериям для усвоения азота нужно переработать больше органического вещества.
Еще сравнительно недавно полагали, что азотобактер и клостридий хорошо «работают» только в почвах, где много растворимых органических веществ. На этом основании многие ученые и практики ставили под сомнение значимость свободноживущих азотфиксаторов в азотном балансе почвы, так как эти вещества в почве не всегда есть. В настоящее время выясняется, что процессы, идущие в почвах, гораздо сложнее, чем представляется на основании изучения почвенных микробов в лабораторных культурах.
Оказалось, что азотобактер и клостридии связаны в своей жизнедеятельности с другими почвенными микробами и с их помощью могут использовать недоступные для чистой культуры продукты, например клетчатку. В почве есть бактерии, разлагающие клетчатку с образованием спиртов и органических кислот; эти вещества и служат углеродной пищей для азотобактера. Эти, так называемые клетчатковые бактерии, в свою очередь, используют азот, фиксированный азотобактером.
Такая «дружеская взаимопомощь и взаимовыручка» — симбиоз двух различных групп микробов — способствует их обоюдному «процветанию». Удалось получить смешанные культуры азотобактера и расщепляющих клетчатку микроорганизмов. Накопление азота в такой совместной культуре составляет 6—14 мг на 1 кг разрушенной клетчатки.
Аналогичные «содружества» обнаружены также у клостридиев с аэробными, расщепляющими клетчатку микробами. В такой «ассоциации» азот фиксируется в количестве 7 мг на 1 г клетчатки. Выявлены также «ассоциации» клостридиев и грибов, тоже способных расщеплять клетчатку.
Сложные взаимосвязи между почвенными микроорганизмами позволяют объяснить фиксацию азота атмосферы в кислых и лесных торфах. А существование этих связей подтверждается многочисленными наблюдениями. Если, например, в почву вносится чистая клетчатка (в виде фильтровальной бумаги), то в ней одновременно быстро размножаются и микробы, разрушающие клетчатку, и азотфиксаторы. В результате количество азота в почве увеличивается с 0,05 до 0,225%. При запахивании на один гектар 2 г соломы (в соломе много клетчатки и лигнина) количество азота в почве увеличивается с 0,7 до 1,31 кг/га, т. е. почти в 2 раза.
Внесение в почву соломы, навоза, компостов и других органических удобрений стимулирует размножение многих почвенных организмов, в том числе и тех микробных «ассоциаций», в которые входят азотфиксаторы. Именно поэтому почва быстро отзывается на удобрение повышением фиксации азота.
Дополнительным источником энергии для свободноживущих азотфиксаторов служат корневые выделения высших растений. Отсюда вытекает, что чем больше масса корней, тем активнее должны работать азотфиксаторы. Иными словами, обильный урожай хотя и уносит из почвы азот, но в то же время способствует восстановлению его положительного баланса.
Давно известно, что азотобактер и клостридий фиксируют азот атмосферы тогда, когда в среде нет связанного азота солей азотной кислоты и аммиака. Если же эти соли в среде есть, бактерии живут и размножаются, не фиксируя азот воздуха. В почвах постоянно содержится какое-то количество связанного азота. Как же работают в них азотфиксаторы? Исследования показывают, что нитратные и аммиачные азотные удобрения, внесенные в почву в значительных концентрациях, подавляют в ней азотфиксаторы. В то же время органический азот навоза, компостов, зеленых удобрений, даже с примесью небольших количеств минерального азота, значительно стимулирует этот процесс. Объясняется это тем, что с органическими удобрениями вносится много углеродсодержащих веществ (клетчатка и другие). Эти данные имеют большой практический интерес для земледелия.
Процессы фиксации атмосферного азота в почве протекают очень сложно и зависят от множества условий. Можно ли экспериментально установить истинное количество азота, накапливающегося в почве в результате жизнедеятельности свободноживущих микробов? Это стало возможным, когда в исследованиях начали применять изотоп азота (N15).
На основании многочисленных исследований академик И. И. Тюрин пришел к выводу, что свободноживущие азотфиксирующие бактерии за вегетационный период обогащают пахотный слой каждого гектара почвы на 5—10 кг азота. Кроме того, сине-зеленые водоросли и некоторые другие организмы (о них речь пойдет дальше) могут дать дополнительно еще несколько килограммов азота. Е. Н. Мишустин считает, что свободноживущие азотфиксаторы обогащают окультуренные почвы СССР ежегодно не менее чем на 1,5 млн. т азота. По данным американских исследователей, свободноживущие азотфиксаторы накапливают во всех почвах США до 4,37 млн. т азота в год.
Таким образом, свободноживущие микроорганизмы обесцвечивают несколько меньшее накопление азота в почве, чем симбиотические клубеньковые, но и они играют очень важную роль в земледелии, и те, и другие — лидеры соревнования «за большой азот».