Для концентрирования возбудителей зоонозов из объектов внешней среды используют мембранные фильтры.
Материалы и оборудование. 1. Фильтрующие устройства из нержавеющей стали или другого инертного материала (тефлон и др.), соответствующие количеству проб. 2. Штатив для фиксации фильтрующего устройства (1 шт.). 3. Баллон с газообразным азотом (ГОСТ 9293—74) (1 шт.). 4. Компрессор УК-40-2М с электродвигателем для привода компрессора (1 шт.). Компрессор, редуктор и ресивер необходимы в случае отсутствия баллона с газообразным азотом. 5. Манометр МТ-4 (ГОСТ 2405—80) со шкалой 0…600 кПа (0…6 кГс/см2), класс точности 06 (1 шт.). 6. Манометр со шкалой 0…400 кПа (0…4 кГс/см2), цена деления 02 кГс/см2, класс точности 06 (1 шт.). 7. Редуктор РДВ-4 (или РДФ-3) для регуляции и стабилизации давления инертного газа (сжатого воздуха или азота) (1 шт.). 8. Ресивер (1 шт.). 9. Цилиндр измерительный на 0,4…0,5 л с широким горлом (1 шт.). 10. Воронка стеклянная на 0,1 л (ГОСТ 8613—95). 11. Стерильные пробирки стеклянные П-2 биологические (16 х 150) (ГОСТ 10515—75) (50 шт.). 12. Стерильные пипетки измерительные на 1 и 5 мл (ГОСТ 20292) (50 шт.). 13. Чашки Петри стерильные (1 шт. на 1 фильтр). 14. Элективная питательная среда 20…25 мл на один фильтр. 15. Штатив полиэтиленовый или металлический на 40 пробирок (2 шт.). 16. Флаконы стеклянные с закрывающимся горлом на 0,1…0,2 л для взятия проб (20 шт.). 17. Бутыли стеклянные на 0,5 л для забора проб воды (10…20 шт.). 18. Стаканы химические с носиком на 0,25 л ТУ-25-11-944—79 из термостойкого стекла для кипячения фильтров (2 шт.). 19. Стакан фарфоровый на 0,1 мл (ГОСТ 9147—80) для шпателя (1 шт.). 20. Шпатель стеклянный (1 шт.). 21. Металлическая кастрюля на 3…5 л для кипячения фильтровального устройства (2 шт.). 22. Пинцет с плоскими браншами для стерильных фильтров (1 шт.). 23. Пинцет с плоскими браншами для переноса фильтров в чашку Петри (1 шт.). 24. Кювета или крышка от стерилизатора (1 шт.). 25. Скальпель для поднятия края фильтра при съеме с фильтродержателя (1 шт.). 26. Пинцет для проведения смывов с фильтра (2 шт.). 27. Малые стерильные ватные тампоны для смывов с фильтра (100 шт.). 28. Большие стерильные ватные тампоны (2×1 см) для обработки фильтрующего устройства (100 шт.). 29. Спиртовка (1 шт.). 30. Спирт этиловый 96° (200 мл). 31. Мембранные микрофильтры с порами диаметром 0,2 или 0,4 мкм, по размеру соответствующие диаметру фильтродержателя фильтрующего устройства.
Типы микрофильтров (МФ). Для концентрирования и выделения патогенных бактерий из объектов внешней среды по производительности, биологической инертности, обеспечению диффузии питательных веществ из агара через поры МФ предпочтительнее коммерческие отечественные капроновые мембраны типа МИФИЛ с порами размером 0,4 и 0,2 мкм или мембраны из ацетата целлюлозы «Владипор» типа МФАС-Б с порами размером 0,2…0,4 мкм. Мембраны «Владипор» типа МФАС Б-2 (0,2 мкм), МФАС Б-3 (0,3 мкм), МФАС Б-4 (0,4 мкм) выпускают в виде рулонов.
При отсутствии рекомендуемых типов мембран можно использовать мембраны «Владипор» типа МФА-МА № 3 (0,25…0,35 мкм) или № 4 (0,35…0,45 мкм). Однако эти МФ имеют пониженную скорость фильтрации, а в некоторых партиях содержатся вещества, вызывающие спонтанную гемагглютинацию. Поэтому эти фильтры перед применением необходимо проверить по данному признаку.
Подготовка и стерилизация микрофильтров. Из рулона по трафарету выкраивают круглые фильтры (если нет готовых стандартных), соответствующие диаметру фильтродержателя. При этом не следует касаться рабочей поверхности фильтров пальцами, так как нарушается их смачивающая способность и быстрота фильтрации. Количество МФ должно соответствовать числу проб, поступивших на анализ.
МФ помещают по 10…20 шт. в стаканы из термостойкого стекла, на дно которых кладут прокладку из нержавеющей сетки. Заливают горячей (70…80 °С) дистиллированной водой, нагревают на слабом огне и кипятят 5 мин. Затем воду меняют и вновь кипятят 5 мин.
Необходимо следить, чтобы кипячение происходило на слабом огне с целью предупреждения коробления МФ. Стерильные МФ переносят за край пинцетом в фильтродержатель.
Подготовка к работе фильтрующего устройства. Фильтрующее устройство стерилизуют кипячением в течение 10…15 мин или в автоклаве при 120 °С в течение 10 мин.
Фильтродержатель фиксируют в штативе. В него помещают сетку с отверстиями из стекловолокна тефлона или пористой стали, которая служит поддержкой для МФ, затем кольцевидную резиновую или тефлоновую прокладку. На сетку пинцетом кладут стерильный МФ рабочей (глянцевой) поверхностью кверху, а на него вторую кольцевидную прокладку. К фильтродержателю присоединяют стакан фильтрующего устройства; это соединение должно быть герметичным.
Фильтрующее устройство готово к работе.
Техника мембранной фильтрации. Исследуемые пробы воды или других объектов, переведенные в жидкую фазу, регистрируют, затем перемешивают и с помощью стерильной воронки заливают через верхнее отверстие стакана фильтрующего устройства. Отверстие герметично закрывают запорной крышкой с резиновой прокладкой. К боковому штуцеру, расположенному в верхней части стакана, присоединяют шланг из фторопласта, через который подается газ — азот или сжатый воздух, находящийся в баллоне или в специальном сосуде-ресивере. Фильтрация осуществляется при перепаде давления на мембране, равном (100…150) ± 10 кПа. Пробы можно фильтровать через МФ также под вакуумом, однако производительность мембран при этом резко падает.
При завершении фильтрации давление в стакане следует поддерживать еще несколько секунд, чтобы удалить оставшиеся на фильтрах капли жидкости, и только затем газ перекрывают. Верхнюю крышку отвинчивают. При этом давление в стакане падает. Стакан снимают с фильтродержателя, МФ переносят на плотную элективную питательную среду в чашку Петри рабочей поверхностью кверху.
Избегая образования пузырьков воздуха между поверхностью агара и фильтром, чашки помещают в термостат крышками вниз и инкубируют в течение 36…42 ч при 37 °С. В случае необходимости фильтрации большого количества проб фильтрующее устройство обеззараживают кипячением и вновь используют в работе.
Плотные элективные среды для выделения возбудителей с помощью МФ. Питательные среды должны обеспечивать рост при высеве единичных клеток. Для возбудителя сибирской язвы применяют агар Хоттингера или агар на основе гидролизата казеина. В качестве ингибитора посторонней микрофлоры используют полимиксин (50 мкг/мл) и триметоприм (25 мкг/мл).
Для буркхольдерий сапа и мелиоидоза применяют глицериновый 5%-й агар. В качестве ингибирующих рост посторонней микрофлоры в первом случае используют ампициллин (10 мкг/мл) и полимиксин (25 мкг/мл), во втором случае — гентамицин (10 мкг/мл) и полимиксин (50 мкг/мл).
С целью изоляции бруцелл рекомендуется эритрит-агар с 1 % глюкозы, 2 % глицерина, 1 % нормальной лошадиной сыворотки (НЛС) и 0,05 % тиамина. В качестве ингибиторов используют пенициллин (2 мкг/мл) и полимиксин (10 ЕД/мл).
Туляремийный микроб выделяют на средах с кровью и 0,1 % цистина, 1 % глюкозы, 0,12 % тиамина.
Учет результатов. Изолированные колонии, выросшие на поверхности фильтра или на агаре (при посеве смыва с фильтра), подсчитывают и идентифицируют. Для просмотра колоний на МФ используют лупу с 2…4-кратным увеличением или стереомикроскоп.
Колонии идентифицируют ускоренными методами с применением РИГА, МФА или ТИФА. В качестве антигена для этих реакций используют смыв нескольких однотипных колоний. Смыв с МФ проводят стерильным тампоном или шпателем.
МФ помещают в стерильную чашку, добавляют 1 мл физиологического раствора. Чашку устанавливают в наклонном положении. Фильтр фиксируют пинцетом в верхней части, а другим пинцетом с ватным тампоном проводят смыв колоний с поверхности фильтра.
Тампон тщательно отжимают, жидкость переносят стерильной пипеткой в пробирку. Смыв с поверхности агара делают шпателем. Перед постановкой серологических реакций жидкость обеззараживают 4%-м формалином с последующим выдерживанием при 37 °С в течение 1 ч.
Постановку и учет серологических реакций осуществляют согласно действующим инструкциям с применением коммерческих препаратов.
Техника безопасности. Перед началом фильтрации необходимо проверить фильтрующую систему на герметичность путем пропускания 10…20 мл стерильного физиологического раствора или бульона, обращая особое внимание на отсутствие пузырей или капель жидкости в местах соединения стакана с фильтродержателем.
При фильтрации под давлением надо соблюдать требования инструкции по работе с сосудами, находящимися под давлением.
Обеззараживание посуды, инструментов и фильтрующего устройства проводят в соответствии с действующими инструкциями.
Если исследуются объекты, предположительно зараженные спорами сибирской язвы, фильтрационное устройство обезвреживают кипячением в 2%-м растворе соды в течение 1 ч или погружением в 6%-й раствор пероксида водорода, в который добавлено 0,5 % моющего средства.