Факультет

Студентам

Посетителям

Методы ДНК (или РНК)-зондов

Методы ДНК (или РНК)-зондов основаны на реакции гибридизации нуклеиновых кислот — способности односпиральных комплементарных цепей ДНК или РНК формировать двуспиральные структуры. Реакция может протекать между комплементарными молекулами вида: ДНК + ДНК, ДНК + РНК, РНК + РНК.

Геном вирусов, представленный в виде специфической последовательности нуклеотидов в молекулах нуклеиновых кислот, наиболее информативен и является надежным критерием для идентификации.

У большинства ДНК-содержащих вирусов (адено-, герпес-, покс-, папилломавирусы и др.) нуклеиновая кислота находится в виде двух цепей, которые связаны (водородная связь) комплементарно через азотистые основания (аденин—тимин, гуанин—цитозин).

Так, у аденовирусов таких нуклеотидных пар 35—36,5 тыс., у герпесвирусов — 125—240 тыс., у поксвируеов — 130—375тыс. и т. д.

Если водный раствор ДНК нагреть до 100 °С или сильно защелочить (pH >13), то комплементарные пары оснований теряют связь, и ДНК быстро диссоциирует на две отдельные цепи. Этот процесс называется денатурацией или плавлением.

Если комплементарные цепи ДНК выдерживать в течение определенного времени при температуре 65 °С, они легко спариваются, восстанавливая структуру двойной спирали. Этот процесс получил название ренатурация или гибридизация.

Все типы реакций гибридизации зависят от солевого состава среды, температуры инкубации, длины реагирующих цепей, их нуклеотидного состава.

Любой вирус включает одну специфическую для него молекулу ДНК (или РНК) со строго определенной последовательностью нуклеотидов. Чтобы в исследуемом материале обнаружить вирусную нуклеиновую кислоту, можно воспользоваться ее способностью после разделения цепей (если она двуспиральная) образовывать снова двойную цепь с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты, предварительно как-либо помеченной. Такая меченая односпиральная молекула нуклеиновой кислоты, комплементарная молекуле нуклеиновой кислоты определенного вируса, называется ДНК-зондом. Для каждого вида вируса зонд готовят заранее и вводят в него метку в виде атома радиоактивного фосфора (32Р) или в виде биотина, или другим веществом.

Методы ДНК-зондов сводятся к следующему: получение односпирального фрагмента ДНК определенного вируса и его метки — это ДНК-зонд;

выделение из исследуемого материала нуклеиновых кислот и их денатурация;

контакт образовавшихся односпиральных молекул ДНК (или РНК) с ДНК-зондом при 55—65 °С, приводящих к образованию двуспиральных молекул (гибридизация) в случаях их взаимной комплементарности;

удаление всех негибридизированных односпиральных молекул нуклеиновых кислот (отмывают или добавляют нуклеазы);

обнаружение (по метке) образовавшихся двуспиральных молекул нуклеиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в исследуемом материале того вируса, на который был получен ДНК-зонд.

Если использовали радиоактивный зонд, то результаты учитывают методом авторадиографии или путем подсчета импульсов в счетчике.

Существует большое количество модификаций метода гибридизации с мечеными нуклеиновыми кислотами. Их можно разделить на две основные группы: способы гибридизации в растворе и способы гибридизации на твердых носителях.

Наиболее популярен метод гибридизации с использованием носителей — нитроцеллюлозных или нейлоновых фильтров и твердых полимеров. Он заключается в том, что одну нуклеиновую кислоту (чаще исследуемую), предварительно денатурированную, иммобилизуют на носителе (фильтре), проводят гибридизацию с ДНК-зондом и непрореагировавшие молекулы зонда отмывают, а иммобилизованные меченые гибриды остаются на фильтре. Сигнал, подаваемый связанным зондом, обнаруживают посредством авторадиографии, если зонд был радиоактивным, или путем образования цветных пятен, если использовали меченный ферментом зонд.

Достоинства метода: высокая чувствительность и специфичность; быстрота анализа; универсальность; отсутствие необходимости в стерильной работе, математической обработке результатов. Недостатки: относительная технологическая сложность и трудность получения зонда; если метка радиоактивная, то нельзя зонд нарабатывать впрок, так как период полураспада 32Р — 14 сут, а 1311 — 8 сут; если метка нерадиоактивная, то чувствительность метода снижается в 10 раз и более.

Методы ДНК (РНК)-зондов из диагностической практики постепенно вытесняются новым методом — полимеразной цепной реакцией.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: