В почвенно-зоологических исследованиях для определения концентрации гуминовых веществ широко используется метод Кулльманна и Фрейтага (Kullmann, Freitag, 1957).
Этим методом определяется оптическая плотность экстрактов гуминовых веществ при разных длинах волн, а также отдельно оптическая плотность раствора гуминовых кислот и фульвокислот
200 мг тонко измельченного растительного материала, высушенного до постоянного веса, заливают 40 мл 0,5%-ного раствора едкого натра. Экстракция проводится при комнатной температуре в течение 1,5 час. После фильтрования через стеклянный фильтр (№ 3) объем раствора доводят щелочью до 50 мл в мерной колбе и определяют в нем оптическую плотность экстракта гуматов.
Следующий этап анализа — разделение экстракта на фракции гуминовых и фульвокислот. К экстракту добавляют концентрированную серную кислоту по каплям, пока рН не достигнет 2. При этом происходит осаждение гуминовых кислот. Раствор, в котором остаются фульвокислоты, отделяют от осадка на центрифуге при 5 тыс. об/мин в течение 15 мин. В центрифугате определяют оптическую плотность фульвокислот. Осадок гуминовых кислот снова растворяют в едком натре, но перед определением его оптической плотности на спектрофотометре этот раствор следует очистить от остатков фульвокислот. Для этого в раствор снова добавляют по каплям серную кислоту и снова отделяют осадок центрифугированием. Эту операцию повторяют 2—3 раза, пока центрифугат не станет совсем светлым. После этого окончательно растворяют гуминовые кислоты в щелочи, доводят объем раствора до 50 мл и определяют его оптическую плотность.
Кривые поглощения экстрактов гуматов в видимой части спектра можно получить на таких приборах, как спектрофотометры СФ-2М, СФ-4, фотоэлектроколориметр ФЭК-57. Для получения спектра берут 2 кюветы, одна из которых заполнена исследуемым окрашенным раствором, а другая — растворителем. Так как в данном случае растворитель — раствор щелочи, такой же прозрачный в видимой части спектра, как вода, для второй контрольной кюветы можно использовать дистиллированную воду.
При измерениях наиболее точные показания получаются в средней части спектра при оптической плотности между 0,8 и 1,3. Это нужно учитывать при подборе кювет. Чем толще слой раствора в кювете, тем выше его оптическая плотность. После нескольких пробных измерений нужно использовать кюветы такого объема, чтобы оптическая плотность оказалась не ниже 0,8 и не выше 1,3. Вместе с тем нужно стремиться выбрать кювету наименьшего размера из возможных: при малой толщине поглощающего слоя (кюветы длиной 0,5—1,0 см) ошибки от рассеивания света оказываются минимальными.
Измерения оптической плотности проводят при нескольких длинах волн, например, при 465, 533, 574, 619, 665, 726 ммк (либо 400, 450, 500, 550, 600, 700, 750 ммк). В коротковолновой части спектра коэффициенты поглощения света резко уменьшаются. Наглядная сравнительная характеристика гуматов в различных растительных остатках, например в опаде и экскрементах животных, получается при графическом изображении этих кривых. На полулогарифмической бумаге строят графики по координатам: lg коэффициента поглощения света (D) —длина волны (Я). Положение этих кривых и крутизна падения оптической плотности при уменьшении длины волны дает представление о концентрации и составе гуматов в исследуемых субстратах.
Для количественного определения содержания гуматов разработан ряд расчетных методов, из которых наиболее простым и употребительным является метод Вельте (Welte, 1956). По методу Вельте соотносятся оптические плотности растворов, измерение при длинах волн 472 и 665 ммк.