Факультет

Студентам

Посетителям

Метод газожидкостной хроматографии в медицинской и ветеринарной микробиологии

Газожидкостная хроматография (ГЖХ) не относится к иммунологическим методам, ее принцип заключается в быстром (за 2…3 ч) выявлении специфических химических компонентов в клетках патогенных микроорганизмов или продуктах их обмена. Этими компонентами чаще всего являются липиды, в частности жирные кислоты.

Метод прост, точен, легко воспроизводим и обладает высокой разрешающей способностью (Б. М. Митрук, 1978). Сочетание ГЖХ с масс-спектрометрией позволяет в короткие сроки дифференцировать по жирно-кислотному составу большое количество микроорганизмов, т. е. успешно применять ГЖХ для целей таксономии. Например, нет никакой необходимости выделения микобактерий в чистых культурах, так как можно обнаружить в клиническом материале до 5 пг туберкулостеариновой и других жирных кислот, присущих микобактериям (Larsson, 1982; Drucker, 1989).

Летучие метаболиты патогенных бацилл возможно дифференцировать с помощью ГЖХ не только от эшерихий, псевдомонад, сальмонелл, шигелл, иерсиний, но и от некоторых микроорганизмов внутри этого рода (Cochetiere-Collet, 1984).

При анализе состава клеток В. anthracis с помощью ГЖХ были найдены существенные отличия по составу от родственных аэробных бацилл (О. М. Вернер и др., 1988): последние отличались от сибиреязвенного микроба значительным содержанием жирных кислот с 18 атомами углерода и низким содержанием пентадекановой кислоты.

Анализ клеточных жирных кислот бруцслл выявил отличия В. ovis от В. abortus. Оба вида характеризовались наличием следующих жирных кислот: С16:0, С17:0, С17:0 циклопропановая, С18:0, 18:1 и С19:0 циклопропановая. В. ovis дополнительно содержала С15:0. У В. abortus помимо отсутствия С15:0 отмечена низкая концентрация С17:0 и С18:1, а также высокое количество С19:0 циклопропановой кислоты (Coloce et al., 1984).

Сапрофитные лептоспиры содержат больше миристиновой кислоты, чем патогенные; для последних характерен высокий уровень олеиновой кислоты, составляющей вместе с линолевой 47,8…49,2 % (3. П. Васюренко и др., 1985).

В клетках туляремийного микроба, например, методом ГЖХ обнаружены жирные кислоты с четным числом атомов углерода (2-гидроксигексадекановая, 3-гидроксидекановая и 3-гидроксиоктадекановая), которые встречаются только у этого возбудителя и, следовательно, имеют диагностическое значение. Для лабораторной диагностики туляремии важную роль играют четыре длинноцепочечные кислоты: тетраоксеноат, n-тетраоксеноат, гексаоксеноат и n-гексаоксеноат. Были получены новые характеристики внутривидовых таксонов туляремийного микроба.

Для бурхольдерий мелиоидоза специфичными оказались 3-оксимиристиновая, 2- и 3-оксипальмитиновые и циклопропановые кислоты.

Метод ГЖХ особенно эффективен для быстрой идентификации возбудителя ботулизма, его токсина, а также ряда анаэробов из группы клостридий, бактероидов и др. Так, отличали с помощью пиролизной ГЖХ ботулотоксин А и В от типов Е и др. (Gutterige et al., 1980).

Методом ГЖХ изучали гной больных на содержание короткоцепочечных жирных кислот и результаты сравнивали с бактериологическими исследованиями: наличие в образцах пропионовой, изомасляной, масляной или изовалериановой кислот служило достаточным доказательством анаэробной инфекции (Ladas et al., 1979).

Этот метод применили для быстрой диагностики анаэробной бактериемии (Edson et al., 1982). Оказалось, что изовалериановая и масляная кислоты присутствуют в 92 % проб крови, содержащих анаэробы, но не аэробы: изовалериановая кислота характерна для Bacteroides fragilis, масляная — для Fusobacterium spp.

ГЖХ позволяет определить анаэробы через 30 мин после выявления положительных гемокультур. В гное больных с внутрибрюшинными абсцессами, когда изолировали В. fragilis, закономерно выявляли изомасляную, масляную и янтарную кислоты (Nord, 1977). При обследовании 49 больных с анаэробными абсцессами легких, флегмонами и ранами мягких тканей получены соответствующие результаты (Л. Л. Шимкевич, В. Г. Истратов, 1985). К маркерам анаэробной инфекции относят масляную, валериановую и капроновые кислоты (А. Ю. Миронов и др., 1988). В настоящее время жирнокислотные профили у анаэробов служат таксономическим признаком. Они включены в 9-е издание определителя Берги (1997).

Метод ГЖХ был применен для изучения некоторых псевдомонад и иерсиний, прежде всего Р. aeruginosa, а также Y. Pestis (Л. Ф. Зыкин, В. М. Самыгин, И. И. Черченко, В. В. Ананьев, А. А. Степин, И. Н. Пестрецова). Изучили 42 штамма синегнойной палочки, выделенные от хирургических больных, и четыре референтные культуры.

Жирные кислоты микробных клеток и патологического материала исследовали по методу К. М. Синяка с соавт. (1977). ГЖХ-анализ метиловых эфиров жирных кислот проводили на хроматографе «Хром-5», снабженном пламенно-ионизационным детектором и блоком программирования температуры. Прибор оснащен насадочными стеклянными колонками длиной 2,5 м и с внутренним диаметром 3 мм, заполненными 5%-м апиезоном Л на хромосорбе WAW DCMS (60…80 меш.). Температуру термостата изменяли в режиме линейного программирования от 100 до 150 °С со скоростью 7,5 мин-1 и от 150 до 220 °С со скоростью 5 об/мин, после чего выдерживали в изотермальном режиме в течение 8 мин. Время удержания и площади пиков определяли с помощью цифрового интегратора IT-2. Идентификацию пиков проводили на основе сравнения времени удержания стандартов жирных кислот. Количество каждой кислоты определяли по соотношению ее пика и общей площади всех пиков. Статистическую обработку результатов осуществляли общепринятыми методами.

В составе клеток синегнойной палочки обнаружены кислоты с длиной цепи атомов углерода от 10 до 19. Изученные культуры содержали относительно большие количества пальмитиновой (С16:0), пальмитолеиновой (С16:1), метиленгексадекановой (С17:0), олеиновой (C18:1) и метиленоктадекановой (С19:0) кислот.

Данные авторов подтверждают исследования, показавшие, что для Pseudomonadaceae доминирующим компонентом является кислота C18:1.

Данные жирнокислотного состава ЛПС Р. aeruginosa не могут служить основанием для хемотипирования штаммов, поскольку большой разницы между культурами разных серотипов не обнаружили. В литературе имеются сведения о принадлежности различных сероваров Р. aeruginosa к одному хемотипу. Проведенное методом ГЖХ исследование показало, что на основании жирнокислотного состава клеток Р. aeruginosa можно с определенной степенью вероятности идентифицировать возбудителя.

Таким образом, обнадеживающие результаты, полученные при изучении клеток F. tularensis, В. pseudomallei, Legionella pneumophila, а также быстрая диагностика анаэробной инфекции служат обоснованием для применения ГЖХ в лабораториях, которые специализируются в области клинической микробиологии.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: