Факультет

Студентам

Посетителям

Метод флюоресцирующих антител

Принцип метода флюоресцирующих антител (МФА) основан на визуальном учете специфического взаимодействия флуюоресцирующих антител с гомологичным антигеном.

Образующийся при этом комплекс антиген — антитело, меченный флюорохромом, легко обнаружить по характерному свечению в сине-фиолетовых лучах люминесцентного микроскопа.

Этот метод как однофазная серологическая реакция включает лишь первую специфическую фазу; этим он отличается от РА и РП, состоящих из специфической и неспецифической фаз.

Преимущества МФА: 1) экспресс-метод — быстрое получение результатов; 2) довольно высокая чувствительность и универсальность применения для обнаружения различных антигенов (бактериальных, вирусных, риккетсиозных и др.); 3) простота постановки.

К недостаткам МФА следует отнести необходимость специального оборудования — люминесцентного микроскопа, который не всегда имеется в районных ветеринарных лабораториях.

Приготовление люминесцирующих антител из иммунной сыворотки. Принцип получения люминесцирующих сывороток состоит в присоединении флюорохрома к глобулиновой фракции сыворотки путем прочной химической связи. При этом маркированные антитела полностью сохраняют способность специфически соединяться с антигеном. Чаще всего для метки антител используют флюоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ).

Эффективность МФА главным образом определяется специфичностью и активностью люминесцирующей сыворотки. Ее качество зависит от активности и специфичности иммунной сыворотки, качества применения флюорохрома и от применяемой метки.

Приготовление люминесцирующих сывороток состоит из нескольких этапов.

1.Выделение глобулиновой фракции из иммунной сыворотки. Чаще всего прибегают к фракционированию сульфатом аммония. К иммунной сыворотке прибавляют равный объем дистиллированной воды и по каплям при постоянном перемешивании при 4 °С доливают до полунасыщения концентрированный раствор сульфата аммония (750 г на 1 л воды). Смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 12…15 ч до полного выпадения осадка, а затем центрифугируют. Осадок глобулинов, полученный после центрифугирования, либо растворяют и переосаждают вновь, либо промывают полунасыщенным раствором сульфата аммония при центрифугировании.

Недостаток этого способа — наличие в выделенных глобулинах значительной примеси альбумина. Поэтому при приготовлении препаратов для непрямого метода чаще всего используют сульфатно-риваноловый метод.

При этом методе фракционирование белков проводят в две стадии. Первая стадия — удаление альбумина. К сыворотке при постоянном перемешивании доливают 0,3…0,4%-й раствор риванола (на 1 объем сыворотки 5 объемов риванола). Через 30 мин после добавления всего риванола смесь центрифугируют, замеряют объем и для удаления риванола прибавляют порошок активированного угля (до полного обесцвечивания раствора). Количество угля подбирают опытным путем. Активированный уголь удаляют при фильтровании смеси через воронку Бюхнера при отсасывании. Вторая стадия процесса заключается в осаждении глобулинов сульфатом аммония при 50%-м насыщении с последующим удалением соли.

2. Освобождение глобулиновой фракции от сульфата аммония. Проводят при помощи гелевой фильтрации на сефадексе G-25 или G-50 (грубый).

Перед использованием сефадекс помещают в литровый стакан и заливают дистиллированной водой, перемешивают и оставляют для набухания на 8 ч. Затем, освободившись от мелких частиц методом декантации, помещают сефадекс в стеклянную колонку высотой 20…150 см и диаметром 2…10 см. Сефадекс уравновешивают 0,01 М фосфатным буфером, приготовленным на 0,15 М растворе NaCl (pH 7,2), либо 0,1 М фосфатным буфером (pH 8,6). Очистке подвергают 2…4%-й белковый раствор, полученный растворением осадка глобулинов в минимальном объеме дистиллированной воды. Белковый раствор пропускают через сефадекс со скоростью 25…50 мкл/ч. Белок выходит первой фракцией, а сульфат аммония задерживается сефадексом и выходит несколько позже. При правильном выборе размеров колонки разведение падает всего на 10%.

3. Метка иммуноспецифического белка флюорохромом. Для получения конъюгата с минимальным неспецифическим свечением белок метят флюорохромом в условиях, позволяющих получить белковые молекулы с оптимальным молярным отношением МФИТЦ: Мбелок. Количество красителя, которое следует взять в метку, зависит от его чистоты и титра сыворотки. Перед меткой всего количества глобулинов желательно провести пробную конъюгацию небольших количеств белка с разными дозами красителя.

Для идентификации бактерий необходимо добиться интенсивного яркого свечения, резко отличающегося от контрольного: при приготовлении таких препаратов следует применять при метке 30 мг ФИТЦ (с содержанием основного вещества 80 %) на 1000 мг белка.

При приготовлении люминесцирующих сывороток для непрямого метода, предназначенных для исследования тканевого материала, навеска красителя должна быть уменьшена до 12…15 мг на 1000 мг белка.

Обычно процесс метки заключается в том, что в колбу Эрленмейера, помещенную на магнитную мешалку, вносят раствор иммуноглобулина в 0,1 М фосфатном буфере (pH 8,6) (20 мг белка в 1 мл раствора) либо в карбонатно-бикарбонатном буфере (pH 9,0). Рассчитанное количество ФИТЦ растирают в агатовой ступке в небольшом количестве буфера и добавляют сразу или постепенно в раствор белка при перемешивании. Раствор оставляют на магнитной мешалке на 12…15 ч при 4 °С.

Применяют также метод (Clark и Shepard, 1963), при котором белковый раствор помещают в вискозный мешочек и проводят диализ против раствора ФИТЦ в 0,05 М карбонатном буфере (pH 9,5) (0,1 г ФИТЦ на 1 мл буфера).

4. Удаление несвязанного красителя. В колонку с гелем сефадекса G-50, предварительно уравновешенную 0,01 М фосфатным буфером, приготовленным на 0,15 М растворе NaCl (pH 7,5), вводят раствор меченого белка. Элюцию осуществляют тем же буфером. В процессе фракционирования раствора на колонке видно четкое разделение глобулинов, причем ФИТЦ-глобулины выходят первым пиком. После работы колонку с гелем многократно промывают физиологическим раствором, а затем указанным выше буфером и используют многократно. Для очистки 20 мл люминесцирующей сыворотки применяют колонку длиной 50 см и диаметром 2,5 см.

Очищенный конъюгат центрифугируют и консервируют мертиолатом натрия 1 : 100 000.

Контроль люминесцирующих препаратов. Готовую люминесцирующую сыворотку контролируют. Определяют красящий титр и рабочее разведение на той модели, на которой работает исследователь. Титр антител устанавливают в РИД на агаре. Для определения титра антител люминесцирующие сыворотки, предназначенные для непрямого метода, раститровывают в агаре, помещая в резервуары, вырезанные вокруг лунки со стандартным антигеном, взятым в концентрации 1 мг/мл белка. Указанные выше препараты должны иметь титр не менее 1:8.

Для определения концентрации белка и молярного отношения обычно используют спектрофотометрический метод. В настоящее время предложен ряд номограмм, облегчающих процесс расчета и позволяющих сразу по величинам светопоглощения при двух длинах волн — 495 и 280 ммк получать концентрацию белка и молярное отношение (номограмма Уоллеса).

Полноту очистки конъюгата от несвязанного с белком флюорохрома можно определять методом восходящей хроматографии на бумаге. Для этого на дно хроматографического цилиндра наливают небольшим слоем (10…15 мм) подвижный растворитель: 55 мл этанола + 45 мл 0,01 М фосфатного буфера (pH 7,2…7,4). Люминесцирующую сыворотку наносят в количестве 0,01 мл на полоску хроматографической бумаги, отступая от нижнего ее края на 1,5 см. Затем полоску подвешивают в цилиндре так, чтобы ее нижний конец соприкасался с растворителем. Цилиндр плотно закрывают пробкой. Хроматографию проводят в течение 2…3 ч, затем полоску извлекают, сушат и исследуют в УФИ. При полной очистке конъюгата люминесценция на хроматограмме наблюдается только на месте нанесения пробы. При недостаточной очистке выявляется еще одно люминесцирующее пятно.

Модификации МФА. МФА имеет два варианта: прямой и непрямой.

Прямой вариант. Фиксированный мазок красят люминесцирующей иммунной сывороткой, содержащей антитела против искомого антигена. Чаще всего применяют только для идентификации неизвестного антигена. Недостаток — необходимость иметь в наличии сыворотки для каждого вида идентифицируемого микроорганизма.

Непрямой вариант. Более универсальный, так как при помощи одной люминесцирующей антивидовой сыворотки можно выявлять различные виды микроорганизмов. На первом этапе фиксированный мазок обрабатывают немеченной к искомому возбудителю иммунной сывороткой. Если антитела данной сыворотки соответствуют антигену, то они фиксируются на нем. На втором этапе на препарат наносят антивидовую люминесцирующую сыворотку. В результате к образовавшемуся на первом этапе комплексу антиген — антитело присоединяются антитела второй ступени, образуется двойной комплекс, который можно обнаружить в люминесцентном микроскопе.

Приготовление препаратов. 1. Из испытуемых суспензий микроорганизма готовят мазки на тщательно обезжиренных предметных стеклах, ближе к краю. Для удобства работы можно на одном стекле, предварительно размеченном корундовым карандашом или алмазным стеклорезом, делать 6…8 мазков.

2. Мазок-отпечаток из органов биопробных животных делают, прикладывая предметное стекло к поверхности свежего среза исследуемого органа. Отпечаток должен быть по возможности тонким.

3. Мазки из крови готовят обычным способом. Каплю крови наносят на край предметного стекла и распределяют ее равномерно по поверхности шлифованным стеклом.

Мазки подсушивают на воздухе, а затем погружают на 15 мин в фиксирующую жидкость (этанол, метанол, жидкость Никифорова). После фиксации границу исследуемого материала обычно отмечают восковым карандашом на обратной стороне стекла.

Фиксированные препараты до их окрашивания люминесцирующими сыворотками хранят при 0…4 °С не более 2 мес.

Прямой вариант МФА. Сухую люминесцирующую сыворотку в ампуле растворяют в указанном на этикетке количестве дистиллированной воды. После растворения сыворотку рекомендуется отцентрифугировать при частоте вращения 3000…6000 мин-1 в течение 30 мин (эта процедура необязательна). Разведенную сыворотку хранят в пробирке с резиновой пробкой или в запаянной ампуле при 4 °С.

Перед использованием каждой серии люминесцирующей сыворотки следует опытным путем проверить ее рабочее разведение, указанное на этикетке. С этой целью микроскопируют мазки из эталонных штаммов или диагностикума, окрашенные в течение 10…15 мин люминесцирующей сывороткой, взятой в разных разведениях (обязательно на 1…2 разведения выше и ниже рабочего разведения, указанного на этикетке). То максимальное разведение, которое обеспечивает яркое (на ++++ и +++) иммунофлюоресцентное окрашивание микробных клеток, называют красящим титром. В качестве рабочего разведения сыворотки принимают удвоенный красящий тигр. Необходимость опытного определения рабочего разведения обусловливается тем, что оно зависит не только от качества люминесцирующего конъюгата, но и от освещения препарата в используемом люминесцентном микроскопе.

Непосредственно перед окраской препаратов люминесцируюшую сыворотку необходимо развести забуференным 0,15 М раствором NaCl (pH 7,2…7,4) до рабочего разведения в необходимом для работы объеме. Разведенную сыворотку длительно не хранят. К 1000 мл 0,15 М раствора NaCl добавляют 10 мл фосфатного буфера, составленного из 90 мл 0,15 М раствора Na2HPO4 (1 г 620 мг на 100 мл дистиллированной воды) и 10 мл 0,15 М раствора КН2РО4 (2 г 230 мг на 100 мл дистиллированной воды), и проверяют pH.

Фиксированные в течение 10…15 мин препараты помещают во влажную камеру (чашки Петри или эксикаторы, увлажненные 0,15 М раствором NaCl) и наносят пастеровской пипеткой каплю люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении. Окраску производят в течение времени, указанного на этикетке, при комнатной температуре. Затем мазок тщательно промывают 0,15 М раствором NaCl по 10 мин в стеклянных стаканчиках дважды или под текущей струей. Подсушивают на воздухе.

Препараты из нативных материалов, отпечатков органов или культуры тканей окрашивают с использованием метода контрастирования для устранения свечения фона. С этой целью на мазки наносят смесь люминесцирующей сыворотки и бычьего альбумина, меченного родамином. Смесь этих сывороток готовят в удвоенном рабочем разведении. Например, рабочее разведение люминесцирующей сыворотки (1) 1:16, а бычьего альбумина (2) 1:8, смесь составляют из разведения (1) 1:8 и (2) 1:4 и наносят на мазок. Дальнейшая обработка мазков, как при окраске люминесцирующей сывороткой.

Мазки микроскопируют в люминесцентном микроскопе с использованием иммерсионной системы — специального нефлюоресцирующего масла.

Микроорганизмы, окрашенные люминесцирующей сывороткой, меченной ФИТЦ, имеют ярко-зеленое свечение, локализующееся по периферии клетки с характерной для исследуемого вида морфологией. Такое свечение называется специфическим в отличие от неспецифического, при котором происходит равномерное свечение всего тела клетки. Следует иметь в виду, что в препаратах из органов животных и культуры тканей обычная морфология клеток может быть изменена.

Интенсивность свечения оценивают по четырехплюсовой системе:

«++++» — яркая флюоресценция по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с темным телом клетки;

«+++» — яркая флюоресценция периферии клетки;

«++» или «+» — слабое свечение периферии клетки, не контрастирующее с телом клетки.

Положительным результатом считают люминесценцию клеток, оцениваемую на «++++» или «+++», при наличии 2…5 специфических клеток в каждом поле зрения.

Контрольные препараты. Для контроля наряду с основными мазками обрабатывают люминесцирующими сыворотками мазки из гетерологичных видов микробов. Гетерологичные штаммы подбирают, исходя из следующего принципа: микробы, близкие в антигенном отношении к исследуемым микробам; микробы, далеко отстоящие в антигенном отношении от исследуемых микробов; микробы, далекие в антигенном отношении, но сходные по морфологии и по распространению.

Мазки-отпечатки из органов, культуры тканей и других тканевых препаратов обязательно должны сравниваться с контрольными препаратами, что доказывает специфичность свечения (заведомо незаразные препараты, а также мазки, обработанные нормальной люминесцирующей сывороткой).

Непрямой вариант МФА. На фиксированный мазок, содержащий антиген, на 10…20 мин наносят капли различных разведений иммунной немеченой сыворотки против соответствующего микроорганизма в разведениях 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и т. д.

Препараты помещают во влажную камеру для предохранения от высыхания сыворотки. Затем мазки 2 раза промывают 0,15 М раствором NaCl (pH 7,2…7,4) по 10 мин для удаления избытка иммунной сыворотки. Подсушивают на воздухе. Далее на препараты наносят капли люминесцирующей антивидовой сыворотки против глобулинов того вида животного, от которого была получена иммунная сыворотка, в рабочем разведении на 10…20 мин. Мазки промывают и просматривают, как описано выше.

Непрямой вариант МФА имеет преимущество перед прямым: из-за ограниченного набора люминесцирующих антивидовых сывороток (кролика, лошади, барана и т. д.).

В последние годы в МФА стали применять и моноклональные люминесцирующие антитела (МКА), которые имеют преимущества перед поликлональными по специфичности.

Контрольные препараты. Обязательные контрольные препараты — антигены, обработанные различными разведениями нормальной сыворотки; антигены, обработанные люминесцирующей антивидовой сывороткой без иммунной немеченой сыворотки.

Практическое использование. МФА в первую очередь следует применять при особо опасных инфекциях (сибирская язва, сап, мелиоидоз), а также для диагностики медленно развивающихся и трудно культивируемых микроорганизмов (возбудителя туберкулеза и паратуберкулеза).

При сапе МФА является одним из наиболее чувствительных, специфических и достоверных методов быстрого обнаружения возбудителя (в течение 1…2 ч). Для его выявления используют иммуноглобулины диагностические флюоресцирующие сапные моноклональные мышиные сухие. Препарат окрашивает только бактерии сапа, не окрашивая возбудителя мелиоидоза. Чувствительность метода в зависимости от объекта исследования составляет 5 ∙ 104…5 ∙ 106 м. т./мл.

Прямую модификацию используют для диагностики сибирской язвы, бруцеллеза, туляремии, псевдотуберкулеза и т. д. Непрямую методику также с успехом применяют для индикации сибирской язвы, мелиоидоза, туляремии и т. д.

При изучении роли мяса как фактора передачи иерсиниозной инфекции оказалось, что непрямой вариант МФА в 2 раза эффективнее по сравнению с культуральным при выявлении Y. enterocolitica в мясе и мясных продуктах: чувствительность метода составляла 1 ∙ 104 м. т./мл (И. С. Киселева, 2005).

Люминесцентный метод применяют для обнаружения возбудителя туберкулеза в исследуемом материале. Для этого мазки из патологического исследуемого материала хорошо высушивают при осторожном подогревании, фиксируют 10…15 мин в жидкости Никифорова. Затем мазки окрашивают флюорохромными красителями, приготовленными по одной из следующих прописей:

I. 1. Аурамин 0 — 0,5 г

2. Родамин 0 — 0,05 г

3. Дистиллированная вода — 1000 мл

II. 1. Акридин оранжевый — 0,1 г

2. Дистиллированная вода — 1000 мл

Окрашивание производят через фильтровальную бумагу при легком подогревании в течение 15 мин. Затем осторожно промывают мазок водопроводной водой, дифференцируют 3%-м раствором солянокислого спирта (15 с), промывают дистиллированной водой. После гашения фона 0,25%-м водным раствором метиленового синего или водным раствором кислого фуксина (1: 1000) в течение 30 с тщательно промывают препарат водой, высушивают и микроскопируют. Возбудитель туберкулеза светится обычно золотисто-оранжевым цветом на черном фоне (картина звездного неба), цитоплазма микобактерий плотная. Сапрофиты после гашения фона выглядят как серо-зеленые, изумрудно-зеленые или лимонно-золотистые палочки на светло-зеленом фоне.

В настоящее время в лабораториях, занимающихся диагностикой туберкулеза, люминесцентная микроскопия постепенно вытесняет методику окраски по Цилю—Нильсену.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: