Факультет

Студентам

Посетителям

L-формы и некультивируемые микроорганизмы

L-формы. Это микроорганизмы, полностью или частично утратившие клеточную стенку, но при этом сохранившие способность к репродукции и передачи потомству присущих им признаков, включая патогенность.

В определенных условиях L-формы могут реверсировать (восстанавливать клеточную стенку) и превращаться в бактериальные формы.

L-формы описаны у всех патогенных бактерий, но наибольший интерес представляют L-формы бруцелл, микобактерий туберкулеза и листерий, которые довольно хорошо изучены.

Процесс L-трансформации включает несколько этапов.

Формы несбалансированного роста. Для них характерны увеличенные клетки, которые имеют нитевидную, раздутую, неправильную форму. Они могут встречаться в виде чистых культур или в смеси с бактериальными клетками. Представляют собой наиболее распространенный и часто встречающийся этап образования L-форм.

Нестабильные L-формы. Образуются через формы несбалансированного роста. Размножаются поперечным делением, почкованием и с помощью элементарных телец. Характерной морфологической структурой для нестабильных и стабильных L-форм являются элементарные тела (ЭТ), шаровидные образования, нитевидные структуры и аморфная бесклеточная масса.

Элементарные тельца размером 0,2…1 мкм образуются внутри или на поверхности больших тел и шаровидных клеток. Особенно характерно для ЭТ наличие внутренних мембранных структур.

Аморфные бесклеточные элементы состоят из лизированных клеток, обломков мембран, рибосом и ДНК.

Нитевидные структуры имеют вид отдельных тонких нитей или состоят из более толстых извитых жгутов.

Все эти образования представляют единый конгломерат, составляющий основу L-колонии, которая напоминает яичницу-глазунью с более плотным центром и кружевной периферией.

Нестабильные L-формы растут на специальных средах и могут реверсировать в типичную бактериальную форму. Стабильные L-формы не обладают способностью к реверсии в бактериальную форму, но состоят из таких же морфологических элементов, как и нестабильные.

L-формы не растут на обычных средах, нуждаются в сыворотке и факторах осмотической стабилизации, не окрашиваются по Граму, часто не идентифицируются коммерческими сыворотками и не лизируются фагами.

Питательные среды для L-форм. Питательные среды должны быть высокого качества и обеспечивать рост при посеве 10…50 клеток. Оптимальными являются 0,3%-е полужидкие, 0,8%-е полуплотные и жидкие среды, приготовленные на основе триптического перевара мышцы сердца крупного рогатого скота с добавлением 15 % сахарозы, 10 % нормальной лошадиной сыворотки (без консерванта), инактивированной при 56 °С в течение 30 мин, и 1 % гемолизированной крови. За рубежом используют коммерческую среду PPLO-агар.

Нормальная лошадиная сыворотка служит источником необходимых липидов и одновременно ингибирует токсические для роста L-форм компоненты питательной среды, а высокая концентрация сахарозы предохраняет бактерии, имеющие дефектную клеточную стенку, от осмотического лизиса.

L-формы на полужидком агаре сохраняются при 4 °С в течение 6 мес. На полуплотном агаре лучшим способом сохранения L-форм является следующий. Агаровые блоки с хорошо выраженным ростом переносят на свежеприготовленную поверхность агара ростом вниз. Для предохранения среды от высыхания на поверхность агара помещают 2…3 капли физиологического раствора. Посевы сохраняют при 4 °С. Для подавления роста посторонней флоры используют селективные добавки.

Изолированную культуру окончательно идентифицируют с помощью РИГА, МФА, И ФА. Методика изоляции L-форм бруцелл приведена в книге П. А. Триленко «Бруцеллез сельскохозяйственных животных» (М.: Колос, 1976).

Для изоляции L-форм микобактерий туберкулеза применяют полужидкую среду Дорожковой, приготовленную на основе полусинтетической среды Школьниковой: гидроортофосфат калия — 1,5 г, гидроортофосфат натрия — 2,5 г, сульфат магния — 0,5 г, цитрат натрия — 1,5 г, цитрат аммиачного железа — 0,05 г, L-аспарагин — 1 г, глицерин — 30 мл, агар-агар — 3 г, дистиллированная вода — 1000 мл. Ингредиенты соединяют путем последовательного добавления в 500 мл дистиллированной воды при слабом подогревании на водяной бане. Каждый новый ингредиент вносят после полного растворения предыдущего. Затем в 100…150 мл растворяют агар, выливают в солевой раствор и доводят объем до 1000 мл путем добавления дистиллированной воды. Смесь фильтруют через ватно-марлевый фильтр, наливают в колбу вместимостью 400 мл, стерилизуют в автоклаве при 120 °С в течение 20 мин и хранят не более 2…3 мес при комнатной температуре.

За трое суток до посева эту среду разогревают на водяной бане. Берут 100 мл дистиллированной воды, растворяют в ней 200 г химически чистой сахарозы, стерилизуют раствор в автоклаве в течение 20 мин. Затем стерильно добавляют в каждую колбу с 400 мл ранее приготовленной среды 50 мл концентрированного раствора сахарозы и 50 мл нормальной лошадиной сыворотки (без консерванта). Среду разливают в стерильные пробирки и контролируют на стерильность в течение 2…3 сут. С целью предотвращения роста посторонней флоры к среде добавляют антибиотики.

Материал перед посевом гомогенизируют, а затем обрабатывают 3%-й серной кислотой (1 : 1). Центрифугируют при частоте вращения 1000 мин-1 в течение 10 мин, к осадку добавляют 0,2 мл физиологического раствора и высевают на полужидкую среду для L-форм. Параллельно этот материал засевают на среду Левенштейна или любую другую для микобактерий туберкулеза.

Пробирки парафинируют. Режим выращивания: 37 °С, срок — не менее 2 мес согласно Наставлению по диагностике туберкулеза животных (М., 2002, с. 57). Методика обнаружения L-форм листерий детально описана в инструкции по лабораторной диагностике листериоза животных и людей (М., 1987, с. 46…51).

Некультивируемые микроорганизмы. К L-формам близко примыкают так называемые некультивируемые микроорганизмы, или некультивируемые формы (НФ). Эти микроорганизмы не растут ни на каких средах, и их можно обнаружить только с помощью микроскопии (при окраске акридин-оранжем) либо методом флюоресцирующих антител, а также в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

НФ описаны у многих патогенных или условно-патогенных возбудителей: сальмонелл, эшерихий, кампилобактеров и др. Они образуются, когда микроб попадает в неблагоприятные условия, главным образом при голодании. У НФ резко снижается уровень метаболизма клетки, уменьшается количество рибосом, уплотняется цитоплазма, меняется функция мембраны, которая приобретает признаки дополнительных оболочек, свойственных спорам.

Кроме голодания важными факторами, индуцирующими образование НФ, являются низкая температура, повышенная концентрация поваренной соли, ультрафиолет.

Некультивируемые формы способны длительно сохраняться в цистах амеб, инфузориях, водорослях. Эндемичностъ некоторых инфекций, например холеры, ряд исследователей связывают с нахождением холерных вибрионов в виде НФ в воде.

Феномен существования жизнеспособных НФ имеет серьезные последствия для здоровья животных и людей, поскольку известно, что НФ патогенов сохраняют свои вирулентные свойства.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: