Для решения вопроса о роли водорослей в почве качественные методы недостаточны.
Чтобы судить о масштабах деятельности водорослей, нужно знать число их особей и клеток в разных слоях почвы. Решающее значение для почвенно-альгологических исследований имеют количественные методы. К сожалению, они менее разработаны, и до последних лет количественные исследования почвенных водорослей проводились редко.
Количественные методы делятся на культуральные и прямые. Культуральные методы счета, разработанные впервые Бристоль-Роач (Bristol — Roach, 1927с), основаны на последовательном разбавлении почвенной суспензии и на засеве ее в питательные среды на песок, агар или силикогель. Впоследствии были предложены различные варианты культуральных методов счета. В СССР культуральными методами счета пользовались Рихтер и Орлова (1928), Т. Г. Попова (1957) и некоторые микробиологи. Однако культуральные методы количественного учета имеют ряд недостатков и не получили широкого распространения.
Недостатки культуральных методов счета обусловлены 1) крайне неодинаковой скоростью роста отдельных видов, 2) невозможностью подобрать среду, одинаково подходящую для всех групп водорослей, 3) невозможностью добиться равномерного распределения клеток в суспензии, в связи с чем считают не клетки, а особи, и нити в десятки клеток приравниваются к одиночным клеткам. Все это определяет недостаточную точность счета. Кроме того, культуральные методы счета довольно громоздки и при большом числе определений требуют засева и просмотра массы культур. Поэтому большее распространение получили различные варианты метода прямого счета клеток под микроскопом. Для осуществления подсчетов в простейшем случае используются препараты на обычном предметном стекле, передвигаемом с помощью препаратоводителя; может быть приготовлена специальная пластинка из органического стекла, на которую бритвой нанесен ряд близко расположенных параллельных штрихов, охватывающих площадь размером с крупное покровное стекло. Так как водорослей в почве гораздо меньше, чем бактерий, и клетки их достигают значительных размеров, надо признать неудачным использование счетных камер, предназначенных для гематоцитологического анализа. Точно так же не дают достаточно точных результатов попытки считать водоросли подобно тому, как считают бактерии, в нескольких полях зрения.
Мы приводим два наиболее удобных метода прямого счета.
Метод прямого счета в навеске почвы. Из свежей почвы, только что доведенной до воздушно-сухого состояния, берут навеску в 5 мг и размешивают в небольшой капле воды на счетной пластинке или предметном стекле. Крупные почвенные частицы удаляют. Каплю накрывают покровным стеклом и целиком просматривают под микроскопом при большом увеличении (объектив 40). Все обнаруженные клетки сосчитывают. Просмотр и счет ведут от одного края покровного стекла до другого, вдоль нанесенных штрихов или передвигая препарат препаратоводителем. Когда просмотрена первая полоса, переходят к соседней, и т. д. Полученные при просмотре цифры умножают на 200, что дает количество клеток в 1 г почвы. Обычно берут среднее из подсчетов 2—3 разных навесок. Подобным методом прямого счета широко пользуется Роза (Rosa).
Неудобствами метода являются: 1) необходимость немедленного счета в свежих образцах почвы и 2) помехи, создаваемые при просмотре под микроскопом крупными и очень мелкими илистыми частицами почвы.
Метод С. Н. Виноградского в видоизменении Э. А. Штиной. Почву перед подсчетом разделяют на фракции путем отмучивания и центрифугирования; для просмотра используют только те фракции, в которых, как было установлено эмпирически, содержатся водоросли. Для обработки этим методом пригодны не только свежевзятые образцы; если не удается обработать пробы немедленно после сбора, навеску воздушно-сухой почвы в 1 г (или 1 см3 почвы) фиксируют 4%-м формалином и она может быть обработала позднее.
Почвенную пробу взбалтывают в течение 2 минут в 4 мл воды (или в формалине, если проба была зафиксирована); после полуминутного отстаивания взвесь над осадком сливают в центрифужную пробирку; к оставшемуся осадку добавляют 3 мл воды, взбалтывают 1 минуту, отстаивают полминуты и снова взвесь сливают в ту же центрифужную пробирку. Эту операцию повторяют, причем взвесь сливают в ту же или другую центрифужную пробирку. Осадок после трехкратного промывания выбрасывают, поскольку практически водорослей он не содержит, а слитую суспензию разливают в 2 или 3 центрифужных пробирки, стараясь получить примерно одинаковую плотность суспензии, и центрифугируют в течение 1 минуты при 500 оборотах или 2 минуты на ручной центрифуге. Все взвеси, остающиеся после центрифугирования, практически лишены водорослей и исключаются из учета. Каждый из оставшихся осадков доводят дистиллированной водой до определенного объема, в зависимости от густоты суспензии (обычно 10—20 мл) и в дальнейшем изучают отдельно. После тщательного взбалтывания осадка набирают взвесь мерной пипеткой и помещают одну каплю на счетную пластинку или на предметное стекло и быстро закрывают покровным стеклом. Объем капли определяют по числу капель в миллилитре, выпуская взвесь по каплям. Можно считать водоросли не во всей капле, а только в части ее, просматривая, например, каждую вторую или каждую пятую продольную полосу, равную по ширине диаметру поля зрения. Отмечается число встреченных в препарате водорослей, отдельно по систематическим группам (синезеленые, зеленые вместе с желтозелеными и диатомовые). При наличии многоклеточных форм указывается число особей и число клеток.
Количество водорослей во всей суспензии определяется путем пересчета. Для этого найденное число клеток умножают на коэффициент, получающийся от перемножения знаменателя дробной части капли, установленного числа капель в 1 мл взвеси и числа миллилитров взвеси (например, если просчитана 1/5 капли и в 1 мл было 24 капли, а всей взвеси было 20 мл, то коэффициент будет 5X24X20 = 2400). Цифры подсчета всех трех суспензий суммируют, получая количество клеток водорослей во всей пробе.
Сравнение с культуральными методами количественного учета показало ряд достоинств прямого метода. Он более точен и обнаруживает большее число клеток. Так, например, в нашем опыте (Штина, 1956в) при исследовании одной пробы культуральным методом разведений и методом прямого счета было получено: по данным культурального метода — 10 тыс. клеток в 1 г почвы, исключительно зеленые водоросли; прямое микроскопирование дало для той же пробы 176 тыс. клеток в 1 г почвы, в том числе синезеленых 7.2 тыс., зеленых 117 тыс., диатомовых 51.8 тыс. При исследовании подзолистой почвы количество водорослей определялось методом прямого счета и микробиологическим методом разведений (метод титра). Прямой счет дал более высокие показатели и позволил различить отдельные группы водорослей; кроме того, он быстрее (если учесть все операции по подготовке сред и просмотру всех сосудов) и позволяет не только считать, но и наблюдать состояние клеток в почвенных условиях.
Из каждой суспензии обычно просматривается только одна капля (точнее часть капли). Точность счета была проверена сравнением результатов двух повторных просмотров одной и той же суспензии. Оказалось, что данные двух повторностей различались очень незначительно, колебания не превышали 6—10%. Точно так же не получалось существенных различий при обработке двух параллельных образцов, если они были правильно взяты. Однако в ряде случаев возникает необходимость брать пробы и проводить подсчет в двухкратной повторности.
Недостатком прямого метода является его трудоемкость: на обработку всей пробы затрачивается от 2 до 5 часов, в зависимости от механического состава почвы. Кроме того, при просмотре взвеси под микроскопом большую трудность представляет распознавание мелких клеток водорослей среди почвенных частиц, спор грибов и пр. Задача значительно облегчается, если просмотр проводить с помощью люминесцентного микроскопа, так как в ультрафиолетовых лучах хлорофиллоносные клетки дают красное свечение. В этом случае работа ускоряется, но становится трудным распознавание принадлежности клеток отдельных видов или их комплексов, которые наиболее специфичны для каждой данной почвы, что во флористическом отношении значительно лучше охарактеризует ее, чем самый полный список видов.
Вполне назрела задача специальной разработки систематики отдельных групп почвенных водорослей, выявляемых методом культур. При этом существенно важно устанавливать степень морфологической изменчивости этих водорослей в культуре, определять экстремальные и оптимальные условия культивирования и «опасные» факторы, вызывающие искажение их систематической характеристики.