Сущность иммунофлуоресцентной микроскопии заключается в появлении специфического свечения комплекса антиген-антитело в случаях сине — и ультрафиолетового света при условии использования антител, соединенных с флуоресцирующим красителем.
На предметное стекло с мазком из исследуемого материала или гистологическим срезом наносят специфическую сыворотку, меченную флуоресцирующим красителем. Если в препарате содержатся микроорганизмы, специфически родственные меченому антителу, то происходит их связывание. Возникающая комбинация достаточно прочна и сохраняется в процессе тщательного промывания препарата от избытка меченой сыворотки. Присутствие специфически локализованного свечения, выявляемого под люминесцентным микроскопом, указывает на наличие антигена; при его отсутствии свечения в поле зрения микроскопа не наблюдается.
Наиболее часто применяют два метода иммунофлуоресцентного окрашивания: прямой и непрямой. При прямом методе на препарат наносят флуоресцирующий конъюгат, разведенный до требуемого титра, при непрямом — препарат обрабатывают иммунной нефлуоресцирующей сывороткой. Антитела, преципитированные на антигене, выявляют обработкой флуоресцирующей сывороткой, иммунной к γ-глобулинам того вида животного, от которого получена нефлуоресцирующая сыворотка.
Метод иммунофлуоресценции высокочувствителен и позволяет обнаруживать минимальные количества микроорганизмов в исследуемом материале. Указанный метод незаменим при диагностике смешанных бактериально-вирусных заболеваний насекомых, когда число образующихся в пораженных клетках включений незначительно, а также при анализах яиц, личинок младших возрастов и мелких насекомых.
При вирусных заболеваниях методы обычной микроскопии не всегда позволяют уверенно дифференцировать вирусные тельца-включения от белковых клеточных включений и некоторых продуктов метаболизма. Так, в кишечнике пилильщиков в фазе имаго обнаруживается масса образований белковой природы, которые окрашиваются по методам Швецовой и Похила аналогично полиэдрам.
В микробиологии насекомых метод иммунофлуоресценции впервые применен для обнаружения риккетсий Провачека в кишечнике платяной вши. В дальнейшем с помощью иммунофлуоресценции неоднократно обнаруживались энтомопатогенные микроорганизмы в различных насекомых. Применение метода флуоресцирующих антител позволило обнаружить полиэдренный антиген в яйцах тутового шелкопряда и определить его локализацию.
Приготовление иммунных сывороток. Для получения качественных антител против инклюзионных вирусов используют высокоочищенные от посторонних примесей полиэдры и гранулы из больных или погибших насекомых. Если насекомые крупные (гусеницы последних возрастов коконопрядов, шелкопрядов, некоторых совок и др.), то целесообразно использовать гемолимфу. Гемолимфу больных насекомых смешивают с равным объемом воды, тщательно взбалтывают и многократно центрифугируют. Значительно чаще изолируют тельца-включения из мертвых инфицированных личинок насекомых. Для этого трупы гомогенизируют, смешивают с тройным количеством водопроводной воды и оставляют на 2—3 недели при температуре 30°С для более полной дезинтеграции тканей личинок и освобождения вирусных включений. Гомогенат фильтруют через несколько слоев марли, и фильтрат центрифугируют в течение 15—20 мин при 4 тыс. об/мин до просветления надосадочной жидкости. Осадок многократно промывают и в дальнейшем очистку ведут в градиенте плотности сахарозы.
Для получения иммунных сывороток обычно используют кроликов, так как в Институте микробиологии и эпидемиологии им. Гамалеи АМН СССР налажено массовое производство меченной изотиционатом флуоресцеина ослиной сыворотки против γ-глобулинов кролика, которую применяют при непрямом методе окрашивания препаратов. Обескровливают кроликов на 10-е сутки после последней инъекции. Для стимуляции продукции антител животным вводят в мышцу бедра одновременно с последней инъекцией адъювант Фрейнда.
Получение флуоресцирующих антител. Для получения желаемого эффекта при использовании метода флуоресцирующих антител необходимо выделение из сывороток глобулиновых фракций. Их выделяют высаливанием насыщенными растворами химически чистого сернокислого аммония. Весь процесс состоит из следующих этапов: сыворотку смешивают в равных объемах с раствором сернокислого аммония, который добавляют по каплям при постоянном перемешивании смеси; выпавший осадок отделяют центрифугированием или фильтрацией, растворяют в физиологическом растворе, равным по объему исходной сыворотке, и диализируют против физиологического раствора (для этого раствор глобулиновых фракций в герметично перевязанном целлофановом пакете помещают в сосуд с физиологическим раствором, который меняют несколько раз в сутки); диализ проводят до полного удаления из раствора сернокислого аммония. Для контроля применяют химическую пробу на сульфатные анионы с использованием хлористого бария или реактива Несслера. Все операции с сывороткой и глобулиновыми фракциями выполняют на холоде.
Метку полученных глобулиновых фракций осуществляют изотиоционатом флуоресцена. Предварительно необходимо определить содержание белка в растворе глобулина (используют биуретовый метод как наиболее простой). В зависимости от результатов биуретовой реакции готовят 1%-ный раствор белка концентрированием или разбавлением раствора, добавляют 10% 0,5-молярного раствора карбонатного буфера с pH = 9,0 и медленно на холоде вносят порошок изотиоционата флуоресцена из расчета 0,05 мг порошка на 1 мг белкового раствора. Колбу со смесью помещают на магнитную мешалку и держат в течение 10—12 ч при температуре 4° С. Избыток связавшегося с белком красителя удаляют диализом против физиологического раствора в течение 1—2 суток. Полученный конъюгат центрифугируют и консервируют мертиолятом в отношении 1 : 10 000.
При иммунофлуоресцентных исследованиях материала нередко возникает неспецифическое свечение. Особенно часто спонтанная флуоресценция наблюдается при исследовании фиксированных препаратов. Для исключения неспецифического свечения сыворотку обрабатывают обезвоженным порошком, приготовленным из тканей здоровых насекомых. Для этого личинок, у которых предварительно удаляют кишечник, гомогенизируют с равным объемом 0,15 молярного раствора хлористого натрия, добавляют 4 объема ацетона и взбалтывают. Затем центрифугируют 5 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость отсасывают, а осадок повторным центрифугированием промывают 2—3 раза солевым раствором, затем 2 раза ацетоном и фильтруют. Фильтровальную бумагу с осадком высушивают 10—12 ч при температуре 37° С. Высушенный порошок хранят в холодильнике в закрытых флаконах при —4° С. Для адсорбции сыворотки смешивают 1 мл раствора флуоресцирующих антител с 0,1 г приготовленного порошка, сильно встряхивают в течение 30—60 мин и центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин.
Приготовление и окраска препаратов. Методом иммунофлуоресценции можно исследовать нативный и фиксированный материалы. Вирусные антигены выявляются также в парафинированных срезах.
Приготовление препаратов предъявляет особые требования к стеклам. Предметные стекла толщиной не более 1,2 мм тщательно обезжиривают и отбирают без царапин. Покровные стекла применяют наименьшего размера (15X15 мм) и толщиной не более 0,18 мм.
Исследованный тканевый материал должен сохранить структуру и свойства антигенных субстанций. Обычно для иммунофлуоресцентной микроскопии исследуют мазки из больных и погибших насекомых, кляч-препараты и гистологические срезы.
Для исследования мумифицированных насекомых приготовляют водную суспензию и удаляют грубые остатки тканей фильтрованием через несколько слоев марли. Мазки готовят из фильтрата. При минимальном содержании антигена в материале микроорганизмы концентрируют центрифугированием в течение 20—30 мин со скоростью 3000 об/мин.
Прямую окраску препаратов флуоресцирующей сывороткой осуществляют следующим образом. На помещенный во влажную камеру препарат наносят флуоресцирующую сыворотку в рабочем разведении, которое подбирают эмпирически — 1:8; 1:16. Окраску продолжают 10—15 мин при температуре 37° С; затем сыворотку удаляют и препарат промывают дистиллированной водой в течение 3—5 мин. В случае непрямой окраски исследуемого материала на препараты наносят иммунную сыворотку в соотношении 1:10; 1:20; 1:40 и оставляют при комнатной температуре на 15 мин во влажной камере. Затем препарат тщательно промывают для удаления несвязавшейся иммунной сыворотки и подсушивают на воздухе. Сухую стандартную люминесцирующую антивидовую сыворотку растворяют в указанном на этикетке ампулы объеме дистиллированной воды. После растворения сыворотку центрифугируют 30 мин при 3000— 6000 об/мин.
Непосредственно перед меткой препарата люминесцирующую сыворотку разводят 0,15-молярного раствора хлористого натрия (рН = 7,2:7,4) в соответствии с рабочим разведением. Метят антиген 15 мин, затем мазки тщательно промывают дважды в 0,15-молярном растворе хлористого натрия по 10 мин, ополаскивают в дистиллированной воде и подсушивают на воздухе. Интенсивность свечения оценивается следующим образом:
++++ — очень яркая флуоресценция зелено-желтого цвета по периферии микроорганизма, четко контрастируемая с темным телом клетки;
+++ — яркая флуоресценция периферии клетки;
++ или + — слабое свечение периферии клетки, не контрастируемое с телом микроорганизма. Положительным результатом считается люминесценция, оцениваемая четырьмя и тремя крестами.
Как и при методе прямой окраски, параллельно окрашивают и просматривают контрольные препараты, т. е. препараты, заведомо не содержащие выявляемого антигена. Полиэдренные тельца-включения ядерного и цитоплазматического происхождения, встречающиеся в патологическом материале, обнаруживают интенсивную люминесценцию по периферии; гранулы, меченные флуоресцирующими антителами, светятся отдельными точками.
Присутствие в исследуемых препаратах зелено-желтой люминесценции указывает на фиксацию флуоресцирующих антител на антигене, которым являются в рассматриваемых случаях инклюзионные вирусы. При анализах необходимо различать специфическую флуоресценцию антител с зеленоватой первичной флуоресценцией клеток и остатков тканей.