Факультет

Студентам

Посетителям

Иммуноблот

Иммуноблот (ИБ) — разновидность гетерогенного иммунного анализа.

Его сущность состоит в переносе исследуемого вещества с одного твердофазного носителя, который используется для фракционирования, на другой, где с помощью иммунохимической реакции происходит его выявление. ИБ — весьма информативный тест, который нашел широкое применение в иммунологии и других областях биологии и медицины.

Впервые тест предложили Renat et al. (1979) и Towbin et al. (1979). Техника ИБ следующая. Проводят электрофорез исследуемого материала (например, белка). Делают реплики путем блоттинга белков на твердофазный матрикс (например, нитроцеллюлозу). Затем инкубируют с тест-сывороткой и далее с ИГ антител тест-сыворотки, конъюгированным с меткой (фермент или радиоактивный изотоп).

ИБ по чувствительности превосходит РИГА и позволяет быстро определять специфические антигены. С его помощью идентифицировали антигены М. tuberculosis, изучали иммунологическое родство ЛПС энтеробактерий, псевдомонад с холерным вибрионом и кампилобактером, определяли токсигенность штаммов В. cereus, токсина A Clostridium difficile.

ИБ получил наибольшее распространение как тест подтверждения. Так, например, положительная реакция иммуноферментного анализа на СПИД является методом первичного отбора, а в качестве теста подтверждения применяют иммуноблотгинг.

Чувствительность ИБ колеблется в пределах 2,3…35 нг/мл и даже 100 пг/мл. Таким образом, метод ИБ позволяет идентифицировать зоны антигена на твердой фазе, не связывая весь белок с антителами специфической сывороткой. ИБ используют в основном для определения бактериальных и вирусных антигенов и антител.

С помощью ИБ изучали также растворимые антигены В. abortus (Brooks-Alder et al., 1988; Carin-Bastuje et al., 1990). Положительные результаты получены при использовании ИБ для выявления сибиреязвенных антител во время небольшой вспышки в Парагвае (Harrison et al., 1989).

Разработана методика ИБ для лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза (Г. М. Напалкова и др.). Предварительно составляют электрофореграммы штаммов и антигенов этих возбудителей. Затем с гелей получают блоты ЭФ или диффузным переносом на нитроцеллюлозные мембраны. Изучали способность антител связываться с иммобилизованными на НЦМ индивидуальными белками этих возбудителей. Оптимальное время — 3 ч при комнатной температуре. После соответствующих подработок в основных опытах при использовании иммунных сывороток на НЦМ после электрофореза переносили антигенный комплекс, выделенный формамидом. После электроблота среди субкомпонентов антигена наибольшую активность проявляли фракции с молекулярной массой 12…35 кД; после пассивного диффузного переноса выявляли лишь низкомолекулярные белки 12…17 кД, что позволило в течение 10 мин после обработки нитроцеллюлозных мембран антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом диагностировать сап и мелиоидоз. С сыворотками к гетерологичным возбудителям опасных инфекций получены отрицательные результаты. После ИБ удалось дифференцировать В. mallei, В. pseudomallei от близкородственных бурхольдерий, иерсиний, различных энтеробактерий и др.

В результате в прямом ИБ специфическую фракцию с молекулярной массой 30…35 кД обнаруживали только у сапного и мелиоидозного возбудителей; у других микроорганизмов получены отрицательные результаты.

В настоящее время разрабатываются новые марки активированных нитроцеллюлоз, которые позволят осуществить иммуноблот не только пикограммовых и нанограммовых количеств пептидов, но и полисахаридов. Поэтому, учитывая высокую чувствительность, ИБ следует применять для изучения антигенной структуры возбудителей, а также лабораторной диагностики.

Хотелось бы подчеркнуть, что современные методы электрофореза, иммуноэлектрофореза повышают эффективность лабораторной диагностики при изучении антигенной структуры возбудителей, изоляции специфических фракций и протективных антигенов и т. д. В дальнейшем по мере совершенствования они будут, несомненно, модернизироваться, что повысит их чувствительность и производительность.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: