Факультет

Студентам

Посетителям

Гибридизация нуклеиновых кислот. Метод ДНК-зондов

Молекулярная гибридизация имеет большое преимущество перед остальными системами идентификации, и прежде всего в тех случаях, когда по разным причинам изменено внешнее проявление диагностического признака, так как в генетическом материале очень редко происходят столь большие изменения, которые бы привели к ложноотрицательному результату.

Есть и другие доводы в пользу гибридизации:

  • с помощью зондов (зонд — определенный фрагмент ДНК, содержащего известный ген — генетический маркер) можно обнаружить микроорганизмы, которые трудно культивируются in vitro;
  • зонды позволяют отличить вирулентные штаммы от авирулентных in vitro;
  • быстрая идентификация микроорганизма непосредственно в биологическом материале от больных животных, пробах из окружающей среды и в фиксированных спиртом или формалином образцах после хранения;
  • нет необходимости направлять образцы для идентификации в специализированные лаборатории и институты;
  • высокая достоверность выявления единичных микробных клеток.

Принцип метода. Метод основан на специфическом взаимодействии (гибридизации) двух образцов ДНК: меченого ДНК-зонда и участка плазмидной или хромосомной ДНК (Г. Бантинг и др., 1990). Образовавшиеся двухцепочечные ДНК отделяют от одноцепочечных и определяют присутствие метки. В качестве контроля используют ДНК известного штамма микроорганизма. Степень реассоциации таких гомологичных одноцепочечных ДНК принимают условно за 100 %. При 60…100 % гомологии ДНК можно говорить о принадлежности сравниваемых бактерий к одному виду.

Проведение реакции. Разработаны два способа гибридизации: в растворе или с использованием нерастворимого носителя. Гибридизация на носителях применяется значительно шире: анализируемый образец связывается с нитроцеллюлозным или нейлоновым фильтром.

Для микробиологов больше подходит метод гибридизации in situ, позволяющий быстро проводить идентификацию бактерий. Сначала исследуемые бактерии подращивают на фильтре, либо переносят на фильтр с агара, либо наносят на фильтр небольшие количества бактериальной взвеси. Затем клетки лизируют, высвободившуюся ДНК фиксируют прогреванием. Следующий этап — проведение гибридизации на фильтре с внесенным меченым ДНК-зондом. После гибридизации фильтр несколько раз промывают специальными растворами и проводят детекцию метки.

Существует несколько разных методов мечения комплекса между зондом и ДНК-мишенью. Традиционным способом является радиоактивное мечение зонда с помощью введения в ДНК радиоактивных изотопов 33Р, 32Р, 35S. После гибридизации образцы-мишени выявляют с помощью радиоавтографии. Этот метод обладает высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать около 1 пг ДНК. Недостаток радиоактивных зондов — их нестабильность из-за непродолжительного времени жизни изотопов (32Р — 14,5 сут) и быстрого радиолиза зонда. Использование изотопов с более продолжительным периодом полураспада приводит к снижению чувствительности и удлиняет время, необходимое для радиоавтографии. Кроме того, для работы с изотопами необходимы специально оснащенные лаборатории.

Наиболее широко используют нерадиоактивное мечение. Для нерадиохимической детекции применяют методы, основанные на присоединении к зондам остатков биотина (G. Gebeyehu et al., 1987). Биотин (витамин Н), широко распространенный в природе и синтезируемый кишечными микроорганизмами, сам по себе меткой не является, но он обладает высоким сродством с авидином (стрептавидином). Авидин — глюкопротеид яичного белка, связывающий биотин с образованием нерастворимого комплекса биотин—авидин. Используя биотинилированный фермент и зонд, несущий один или несколько остатков биотина, можно осуществить ферментативную детекцию связанного с мишенью зонда. Авидин связывается с образовавшимся комплексом из двух гомологичных цепей ДНК и присоединяет биотинилированный фермент, который выявляют с помощью соответствующего окрашенного субстрата. Метод обладает более низкой чувствительностью, чем радиохимический. Повысить чувствительность можно, увеличив число остатков биотина, введенных в зонды.

Метод дот-гибридизации. В случаях, когда необходимо установить наличие или отсутствие в ДНК выявляемой последовательности, применяют метод дот-гибридизации. В этом случае очищенную денатурированную ДНК наносят непосредственно на фильтр, иммобилизуют, гибридизируют с зондом и регистрируют на автографах положительные сигналы.

В настоящее время используют зонды для обнаружения бактерий родов Salmonella, Campylobacter, Mycobacterium и др. Успешно разрабатываются зонды и для представителей рода Yersinia. Предложен зонд для идентификации вирулентных Yersinia enterocolitica (V. Е. Hill et al., 1983). В качестве зонда протестированы 8 перекрывающихся областей плазмиды вирулентности (pYV) Y. enterocolitica, а также inv- и ail-области хромосомы, ответственные за способность к инвазии Y. enterocolitica (R. М. Rohins-Browne et al., 1989). Зонды на основе mv-гена Y. enterocolitica гибридизовались со всеми видами и биотипами иерсиний (но не других бактерий). Зонды из ail-области Y. enterocolitica давали положительный сигнал исключительно с патогенными Y. enterocolitica.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: