Факультет

Студентам

Посетителям

Фиксация и заливка пыльников растений для электронно-микроскопических наблюдений

«В настоящее время наиболее распространенный метод сохранения ткани для исследования ее в электронном микроскопе — метод двойной фиксации, т. е. фиксации в глутаральдегиде с последующей дофиксацией в четырехокиси осмия. Этот метод сочетает в себе преимущества обоих фиксаторов. При такой фиксации сохраняется структура органелл цитоплазмы и наиболее полно сохраняются химические компоненты, чем при фиксации только четырехокисью осмия. Дополнительная фиксация ткани в четырехокиси осмия стабилизирует некоторые нейтральные липиды и большую часть фосфолипидов.

Перед фиксацией с помощью светооптического микроскопа определяют фазу развития пыльников. Для этого из каждого бутона вынимают пыльник или часть его и окрашивают в ацетокармине. Установив фазу развития на одном пыльнике, остальные фиксируют 2.5 %-ным свежеприготовленным раствором глютаральдегида на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.1—7.3) при комнатной температуре в течение 1.5—3 ч или оставляют в холодильнике при 4 °С на ночь (16 ч). Зафиксированный материал промывают охлажденным до 4 °С 0.1 М фосфатным буфером (рН 7.1—7.3) не менее 3 раз, держа по 1 ч в каждой смене или оставляют в 3-й смене на ночь при 4 °С. Затем пыльники дофиксируют 2 %-ным раствором четырехокиси осмия, приготовленном на том же буфере, что и фиксатор, при 4 °С от 4 до 16 ч. После дофиксации материал промывают охлажденным 0.1 М фосфатным буфером или помещают сразу в 30 %-ный этанол при 4 °С на 10 мин. Обезвоживание проводят сначала в спиртах возрастающей концентрации, затем в смеси спирта с ацетоном и в абсолютном ацетоне в следующем порядке: 50 %-ный спирт — 15 мин, 70 %-ный — 15 мин, 85 %-ный — 15 мин, 96 %-ный — 15 мин, 100 %- ный спирт — 30 мин, смесь абсолютного спирта и абсолютного ацетона (3:1) — 30 мин, 1:1 — 30 мин, 1 : 3 — 30 мин, абсолютный ацетон первый раз — 1 ч, второй раз — 1ч.

До 96 %-ного спирта обезвоживание проводят при 4 °С в холодильнике, далее вся обработка проходит при комнатной температуре.

Если в процессе фиксации материал требует дополнительного контрастирования, то его окрашивают 2 %-ным раствором уранилацетата в 70 %-ном спирте в течение 3—16 ч при 4 °С.

Обезвоженный материал помещают в смесь абсолютного ацетона и эпоксидных смол (эпона или аралдита) на ночь (16 ч) в термостат при 37 °С. Затем добавляют одну часть смолы и оставляют при той же температуре на 6 ч. После этого на ночь оставляют пузырьки с материалом без пробок, и снова добавляют одну часть смолы и оставляют в термостате при 37 °С на 4 ч или при комнатной температуре на ночь.

Далее материал заливают в свежую смолу (эпон или аралдит) в желатиновые капсулы или в ячейки из-под таблеток. Пропитка и полимеризация проводятся в термостате при температуре 37 СС I сут, затем при 60 °С еще 1 сут.

Эпон для заливки готовят по прописи Уикли (1975).

Сходным образом фиксируют материал для изучения завязи, семяпочки, зародышевого мешка, зародыша и эндосперма.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.



Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: