Наиболее результативными являются бактериологические высевы, имеющие своей целью выделение культуры Br. ovis.
Методика высевов. Материалом для высевов могут быть пораженные придатки семенников, а также семенники, плацента Сортировавших овен, или овец, родивших нежизнеспособных ягнят. Кроме того, от овец, хотя и редко, могут быть выделены типичные культуры Br. ovis из характерных очагов, обнаруживаемых в легких, вымени, рогах матки. Показателем для успешного бактериологического исследования является наличие в сыворотке крови овец антител против Br. ovis. Поэтому для бактериологического исследования следует отбирать овец, реагирующих положительно по РДСК, в особенности и период окотов или в близкий срок после них (1—1,5 мес).
Посев из пораженных придатков и семенников нужно производить следующим образом. После отделения кожи от тканей в области пораженного придатка семенника и прижигания шпателем места над предполагаемым некротическим очагом (очагами) делают острым стерильным скальпелем длинный разрез по уплотненной ткани хвоста придатка или других его участков. Помощник пинцетами раскрывает на обе стороны рассеченную ткань. При обнаружении на разрезе очажков любой величины из них берут пастеровской пипеткой материал и засевают на подготовленную питательную среду.
Наиболее удовлетворительной средой для получения культур Br. ovis является плотный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (ППГГА), в который добавляют 20% стерильной сыворотки крови овец или крупного рогатого скота. Применяют также полужидкий сывороточный агар и сывороточно-декстрозный агар. Из плаценты материал для посева следует брать из пораженных ее участков, а также из утолщенных плодных оболочек. Материал берут стерильными пастеровскими пипетками. У абортированных плодов берут посевной материал из легких, желудка, желчного пузыря, селезенки, печени.
При взятии материала от реагирующих положительно по РДСК с антигеном Br. ovis (овец и ягнят) необходимо найти очаги некроза (легкие, вымя, матка, печень, а у ягнят-баранчиков, кроме того, пораженный придаток или семенник) и делать посев из пораженных участков. Посевы материала, взятого из плаценты или из содержимого полости плодных оболочек, открытых некротических очагов, необходимо производить на плотные питательные среды в бактериологические чашки.
Очень большое значение имеют условия культивирования посевов. Культуру Br. ovis невозможно получить на рекомендованных нами средах, если не будут созданы соответствующие условия в сосудах, в которых выращивается Br. ovis. Одним из таких условий является замена в указанном сосуде 15—20% кислорода углекислым газом или азотом. Кроме того, сосуд должен герметически закрываться и быть обязательно глубоким, чтобы поставленные в него пробирки углублялись от поверхности крышки на 10—15 см. При использовании микроанаэростатов замену кислорода углекислым газом или азотом дозируют на манометре. В практике часто пользуются стеклянными эксикаторами, в которых сжигают вату в момент закрывания их притертой крышкой. Этот метод вполне удовлетворительный, если эксикатор глубокий и в него помещают небольшое количество пробирок (один ряд в стоячем положении). Не рекомендуется сжигать в эксикаторах спирт. Необходимо ежедневно следить за герметичностью сосуда в течение 6—9 дней.
Культивирование посевов производят в термостате при 37,5° С. Просмотр культур для определений типичных колоний Br. ovis и их отсева производят через каждые 3 дня в течение 15 дней. На сывороточном ППГГА колонии иногда вырастают через 2—3 сут, чаще на 4—8-е сутки и реже позднее — на 11—15-е сутки. Колонии Br. ovis по величине и форме неотличимы от колоний бруцелл других видов, находящихся в S-форме. Средняя величина колоний Br. ovis от 0,2 до 3 мкм в диаметре, они янтарного цвета при просмотре через среду, круглые, выпуклые. Иногда колонии, в особенности старые, на плотной среде приобретают желтоватый оттенок. Первичный рост может быть также в виде тонкого налета на поверхности среды, иногда, как и у колоний, возникает желтоватый оттенок культуры.
На полужидком сывороточном агаре рост чистой культуры Br. ovis бывает только в верхней части пробирки в виде умеренного помутнения питательной среды. Средняя высота слоя помутнения от 0,4 до 1 см. Клетка Br. ovis неподвижна, спор и капсул не образует, по методу Козловского окрашивается, как и клетки других видов бруцелл (Br. abortus, Br. melitensis, Br. suis). Микроорганизмы вида Br. ovis не разлагают углеводы в дифференциально-диагностических средах, вызывают помутнение бульона в течение суток, сероводород и нидол не выделяют, желатину не разжижают, не разлагают мочевину, не редуцируют нитраты и нитриты. Проба с метиловым красным (метилрот) и реакция Фогес—Проскауэра отрицательные. Культуры в пробе с трипафлавином определяются как R-форма.
Серологическая идентификация культур. Из полученной культуры, сходной по морфологии с Br. ovis, готовят суспензию на изотоническом растворе хлорида натрия, содержащую 4—5 млрд. микробных тел в 1 мл раствора, и вводят внутривенно кроликам в дозе 2 мл для определения культуры по ее иммунологической характеристике. Через 10-15 дней после введения суспензии у кроликов берут кровь, отделяют от нее сыворотку и исследуют по РДСК. Одновременно в опыт исследования по РДСК в качестве контролей берут: 1) 2 испытуемые сыворотки, полученные от кроликов; 2) 1—2 известные сыворотки, иммунные против Br. ovis; 3) 1-2 известные сыворотки бруцеллезные; 4) 2 известные сыворотки негативные.
Эти сыворотки исследуют параллельно по РДСК со стандартным антигеном Br. ovis, и стандартным бруцеллезным (S-антиген), выпускаемым биопромышленностью СССР.
Изучаемая культура может быть отнесена к виду Br. ovis, если ее кроличьи антисыворотки дают полную задержку гемолиза с антигеном Br. ovis (положительная реакция), а с бруцеллезным антигеном дает полный гемолиз (отрицательный результат), при одновременном получении соответственных результатов с контрольными сыворотками и двумя указанными, выше антигенами.